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嘉峪檢測網(wǎng) 2024-11-22 17:58
肝移植是終末期肝病唯一的根本治療方法，但供體短缺導(dǎo)致供需失衡。整體肝臟生物工程作為解決這一問題的潛在途徑，主要包括肝臟脫細胞化和重新細胞化。脫細胞化保留了肝臟的細胞外基質(zhì)和血管、膽管網(wǎng)絡(luò)，重新細胞化則通過適當(dāng)?shù)募毎亟ǜ闻K功能。本文綜述了該領(lǐng)域的最新進展、面臨的挑戰(zhàn)，并探討了未來的臨床應(yīng)用前景和監(jiān)管措施。
1. 引言
慢性肝病，包括肝硬化、病毒性肝炎和肝癌，仍然是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因之一，每年約有200萬人死于肝病，占全球死亡總數(shù)的4%。此外，肝病還帶來了高昂的醫(yī)療成本，給經(jīng)濟和財政帶來了沉重負擔(dān)。例如，2016年美國用于肝病患者的醫(yī)療支出就超過了325億美元。異體肝移植仍然是治療肝病的黃金標(biāo)準(zhǔn)，尤其是對于終末期肝病患者。盡管肝移植是全球第二大常見實體器官移植，但可用肝源數(shù)量與等待移植的患者數(shù)量之間仍存在顯著差距。這一差距導(dǎo)致全球肝移植需求僅得到不到10%的滿足，導(dǎo)致等待移植的患者死亡率顯著上升。
為了彌補這一差距，研究人員使用組織工程方法研究了不同的替代治療策略。組織工程作為再生醫(yī)學(xué)的一個卓越領(lǐng)域，旨在將支架、細胞和生物活性分子組合成功能性組織，以恢復(fù)、維持或改善受損組織或整個器官。脫細胞化作為一種組織工程技術(shù)，已被用于為未來的移植提供可用的器官庫(圖1)。脫細胞化是指使用化學(xué)、物理和/或生物方法，從組織或器官中最大程度地去除細胞和核物質(zhì)，同時保留其生化成分、生物活性、三維結(jié)構(gòu)和細胞外基質(zhì)的完整性。如果成功，脫細胞化將有助于開發(fā)模擬天然組織機械、生物和解剖特性的支架。去細胞化后，肝臟支架需要植入具有適當(dāng)特性和功能的新細胞。除了肝實質(zhì)細胞外，重建血管和膽管樹網(wǎng)絡(luò)對于生產(chǎn)出可移植到人體的完全功能性生物工程肝臟也是必不可少的。
多項已發(fā)表的研究表明，生物工程肝臟的生成效果令人期待。本文探討了生物工程肝臟制造的最新進展，重點關(guān)注了重大障礙，例如細胞外基質(zhì)的免疫原性、去細胞化技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化以及用于再細胞化、再內(nèi)皮化和膽管重建的合適細胞類型的鑒定。此外，本文還總結(jié)了用于評估生物工程肝臟功能的各種體內(nèi)移植模型。最后，本文討論了監(jiān)管措施，并展望了生物工程肝臟療法的安全性和有效性的未來前景。
多項已發(fā)表的研究已證明，生成生物工程肝臟具有良好的前景。本綜述探討了生物工程肝臟制造的最新進展，重點關(guān)注了細胞外基質(zhì)免疫原性、脫細胞技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化以及確定適合再細胞化、再內(nèi)皮化和膽道重建的細胞類型等重大障礙。此外，還總結(jié)了用于評估生物工程肝臟功能的不同體內(nèi)移植模型。最后，本綜述討論了監(jiān)管措施，并提供了確認生物工程肝臟治療的安全性和有效性的未來前景。
2. 脫細胞肝臟的來源
可用于脫細胞處理的肝臟來源多種多樣。過去二十年，小鼠、大鼠、雪貂、兔子、綿羊、豬和人類的肝臟均被用于脫細胞處理。從臨床角度來看，小鼠、大鼠、雪貂和兔子的脫細胞肝臟由于肝臟體積小和其他生理差異，不適合人體臨床移植。由于長時間缺血、過度脂肪變性、尺寸不匹配或質(zhì)量差而不適合同種異體人體移植的肝臟可能是一個有利的來源。2016年，美國采購了739個肝臟但未進行移植，占美國移植總數(shù)的9%。到2021年，被丟棄的肝臟數(shù)量已上升至總移植量的10%這些廢棄的肝臟未來有可能被用于去細胞化和再細胞化的過程。
使用人體器官的一個顯著缺點是細胞外基質(zhì)(ECM)會隨著年齡的增長而發(fā)生改變。據(jù)報道，隨著年齡的增長，肝臟的硬度增加，彈性下降。這是由于膠原蛋白含量增加、瘢痕組織形成以及晚期糖基化終產(chǎn)物在ECM上積累引起的ECM交聯(lián)所致。這些ECM微結(jié)構(gòu)的變化可增強ECM對酶消化的抵抗力，導(dǎo)致人類肝臟之間出現(xiàn)顯著差異。
豬由于器官大小匹配、可用性、成熟速度快、產(chǎn)仔量大、生理代謝和免疫系統(tǒng)與人類相似，且近十年來豬的基因工程技術(shù)取得了重大進展，被認為是人類規(guī)模肝臟生物工程最合適的來源。容易獲得年齡相近的豬肝可能會限制與年齡相關(guān)的ECM生物學(xué)差異的影響，從而促進脫細胞過程的標(biāo)準(zhǔn)化。因此，從無病原體豬身上獲取的肝臟可能是用于移植的生物工程肝臟的重要來源。
3. 豬肝與人肝的區(qū)別
由于豬肝可能是移植的潛在來源，因此有必要詳細了解豬肝和人肝在結(jié)構(gòu)和微觀結(jié)構(gòu)方面的差異。成年人肝臟呈楔形，分為2葉(左葉和右葉)，平均體積為1862cm3。相比之下，成年豬肝呈小葉三葉草狀，分為4葉(右側(cè)葉、右中葉、左中葉和左側(cè)葉)，平均體積為652-1120cm3。盡管存在這些差異，但根據(jù)先前的研究，兩種肝臟都分為8個相似的段。
人體肝臟中的肝動脈有兩條分支，即左肝動脈和右肝動脈，分別供應(yīng)相應(yīng)的肝葉。豬肝動脈在到達肝門前分為左右兩支，右支進一步分為右內(nèi)側(cè)支和右外側(cè)支，為肝右葉提供血供。同樣，左支也分為3支主要動脈，左內(nèi)側(cè)支和左外側(cè)支(均供應(yīng)左葉)，方支供應(yīng)方葉和膽囊。由此可以得出結(jié)論：豬肝臟與人肝臟的動脈血液供應(yīng)沒有顯著差異。
兩種物種的膽管系統(tǒng)在解剖學(xué)和功能上相似，而膽管分割與門靜脈分割相同，因為它們在格里森鞘內(nèi)有共同的軌道。豬肝膽管引流的一個顯著特點是：豬I段膽管引流是通過右肝管進行的，而人I段膽管引流是通過左肝管進行的。就組織微觀結(jié)構(gòu)而言，豬肝和人肝均表現(xiàn)出相似性。實質(zhì)結(jié)構(gòu)組織成邊界清晰的六邊形小葉，以中央靜脈為中心，其角落處有門管三聯(lián)體。這些小葉由大型多邊形肝細胞組成，這些肝細胞堆疊在一起，并由含有不同數(shù)量結(jié)締組織的纖維隔膜隔開。這些肝細胞估計約占肝組織的80%，而其他非實質(zhì)細胞占20%門脈三聯(lián)由肝動脈、門靜脈和膽管組成，周圍被疏松結(jié)締組織包圍。重要的是，肝竇位于肝細胞條帶之間，流入中央靜脈主要的組織學(xué)差異是存在較多的膠原蛋白，尤其是在豬肝小葉周圍的結(jié)締組織隔膜中，而人類肝實質(zhì)中沒有這些隔膜。Estermann等人評估了豬肝和人肝的機械性能他們報告稱，豬肝比人肝更硬，這可能是由于兩種組織之間的組織學(xué)差異造成的。此外，豬肝與人肝相比，拉伸負荷更高，但粘彈性能無差異。
4. 生物工程肝臟臨床應(yīng)用的障礙與挑戰(zhàn)
4.1 ECM免疫原性
器官脫細胞是制造ECM支架的關(guān)鍵工序，旨在消除免疫原性細胞材料，從而降低同種異體和異種異體衍生支架的免疫原性。植入后，這些天然ECM支架會發(fā)生一定程度的降解，釋放基質(zhì)肽和生長因子。該過程觸發(fā)巨噬細胞極化從促炎(M1)表型轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡自偕硇?M2巨噬細胞)，促進血管生成并募集干細胞/祖細胞到植入組織進行建設(shè)性重塑總體而言，如果脫細胞組織完全去除了不同來源的免疫原，則其排斥率可能會降低。DNA和異種表位(例如alpha-Gal和Neu5GC)的存在以及ECM的年齡和完整性等因素在影響脫細胞組織的免疫原性方面發(fā)揮著重要作用。
4.1.1 脫氧核糖核酸
一些研究人員強調(diào)了豬源支架內(nèi)殘留DNA的重要性及其對植入后免疫反應(yīng)的影響。雖然尚未廣泛研究ECM中足以引發(fā)負面重塑反應(yīng)的殘留DNA的具體閾值，但許多研究人員建議，脫細胞組織理想情況下每毫克ECM干重應(yīng)含有少于50ngdsDNA。最近，RecordRitchie等人從未加工的豬小腸ECM和滅菌前后的脫細胞ECM中純化DNA。他們將50μgDNA注射到小鼠體內(nèi)，其中有或沒有強共刺激劑，如不完全弗氏佐劑、甲基化牛血清白蛋白和白細胞介素-12。值得一提的是，從未處理、無菌或滅菌的豬ECM中分離的DNA，在未使用佐劑注射時，不會引起排斥反應(yīng)。相反，它在局部誘導(dǎo)了輕微的適應(yīng)細胞因子反應(yīng)，沒有觀察到全身性抗DNA抗體表達，即使劑量比ECM植入預(yù)期的劑量高出約100倍。這項研究，加上美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)沒有對生物支架中DNA的存在施加限制或約束的事實，強調(diào)了DNA含量并不是脫細胞效率的可靠指標(biāo)。FDA的立場基于制造商提交的產(chǎn)品安全數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)支持DNA存在不一定與抗原性相關(guān)的觀點。因此，有必要探索一種替代的、更精確的標(biāo)準(zhǔn)來評估脫細胞組織的抗原性。
4.1.2 異種表位
Alpha-Gal表位(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R)是豬等非靈長類哺乳動物細胞表面發(fā)現(xiàn)的特定碳水化合物結(jié)構(gòu)。由于α1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因突變，這些表位在人類和舊世界猴中不存在人類缺乏alpha-Gal表位，導(dǎo)致產(chǎn)生抗Gal抗體(約占血清抗體的1%)，這主要是由于接觸攜帶這些表位的腸道細菌所致。豬組織和器官(包括肝臟)中廣泛存在alpha-Gal，這使得它們?nèi)菀滓虍惙N移植特異性免疫反應(yīng)而受到排斥。脫細胞化已被證明能夠有效去除或減少豬肝中的alpha-gal含量在非人類哺乳動物中，Neu5Gc(N-乙醇酰神經(jīng)氨酸)表位是異種移植排斥的另一種重要抗原。由于基因突變，人類缺乏功能性胞苷單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶(CMAH)，該酶負責(zé)將Neu5Ac(N-乙酰神經(jīng)氨酸)轉(zhuǎn)化為Neu5GC，導(dǎo)致人體組織中缺乏Neu5GC。因此，人類可能會產(chǎn)生針對Neu5GC的抗體，從而導(dǎo)致含有該抗原的移植物發(fā)生超急性排斥反應(yīng)。遺憾的是，此前在豬肝脫細胞過程中，并未評估過Neu5Gc抗原的存在。因此，從豬肝中去除該抗原的效果仍不確定，這強調(diào)了進一步研究以確定脫細胞后是否需要進行特定酶處理的重要性。
4.1.3 ECM改造
ECM含有不同的隱秘肽，可以刺激或抑制宿主的免疫反應(yīng)。脫細胞化過程可能通過暴露隱藏的免疫原性區(qū)域、將脫細胞組織內(nèi)的惰性分子轉(zhuǎn)化為免疫原性顆粒或消耗免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)來增加組織的免疫原性。例如，嚴(yán)苛的脫細胞程序可能會揭示膠原蛋白的某些隱蔽螺旋和末端抗原位點，從而引發(fā)針對ECM的抗體產(chǎn)生。此外，Adair-Kirk等人還發(fā)現(xiàn)，酶處理可導(dǎo)致層粘連蛋白α5的特定隱蔽表位釋放，從而產(chǎn)生16個氨基酸肽，該肽表現(xiàn)出吸引多形核白細胞(PMN)和巨噬細胞的能力，以及誘導(dǎo)免疫細胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的能力。
彈性蛋白受損會導(dǎo)致彈性蛋白肽的釋放，無論是通過嚴(yán)酷的脫細胞過程還是糖胺聚糖(GAG)的消耗。GAG在保護彈性蛋白免受蛋白酶活性的影響方面起著至關(guān)重要的作用釋放的彈性蛋白顆?？烧T導(dǎo)單核細胞趨化作用，促進T輔助細胞分化為炎癥表型(TH1和TH17)，并促進抗體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
此外，高分子量透明質(zhì)酸(脫細胞ECM中的可識別GAG)通過阻礙抗原和抗體之間的相互作用表現(xiàn)出抗炎作用。它們還激活Toll樣受體(TLR)，即模式識別受體(PRR)的一個特定子集，以及在先天和適應(yīng)性免疫細胞中發(fā)現(xiàn)的CD44受體這些受體的激活與樹突狀細胞成熟度降低、巨噬細胞向M2表型極化增強、T細胞分化為調(diào)節(jié)表型以及活化T細胞凋亡誘導(dǎo)有關(guān)。相反，當(dāng)ECM受到損傷或降解時，會釋放低分子量透明質(zhì)酸。它們通過相同的受體CD44和TLR增強免疫細胞趨化性、樹突狀細胞成熟和巨噬細胞向M1表型極化。
4.1.4 ECM的年齡
ECM來源的年齡是影響ECM基生物材料免疫學(xué)特性的關(guān)鍵決定因素。例如，LoPresti和Brown使用來自不同年齡(12、26和52周)豬的脫細胞小腸粘膜下層(SIS)研究了年齡對來自2或18個月齡小鼠的骨髓巨噬細胞表型和功能的影響。研究結(jié)果表明，與12周齡SIS相比，從52周齡豬身上獲得的SIS可減少2個月齡巨噬細胞中的iNOS生成，并抑制2個月齡和18個月齡巨噬細胞中的Fizz1表達。該研究表明，與年輕對照相比，來自老年動物的ECM會產(chǎn)生不同的巨噬細胞表型，這強調(diào)了從年輕捐贈者那里獲取ECM的重要性，以保持ECM生物材料建設(shè)性重塑的良好結(jié)果。
重要的是，從老年人尸體心臟中提取的心肌經(jīng)過了額外的脂質(zhì)和DNA/RNA去除步驟，以去除老年人心肌中常見的大量脂肪組織，并將核苷酸含量降低到與豬心肌基質(zhì)類似的治療應(yīng)用可接受標(biāo)準(zhǔn)，實現(xiàn)組織的完全脫細胞化。此外，層粘連蛋白、彈性蛋白和生長因子的含量隨著年齡的增長而減少。因此，考慮組織來源的年齡對于預(yù)測潛在的宿主免疫反應(yīng)至關(guān)重要。需要進一步研究獲取肝組織進行脫細胞化的最佳年齡，以生產(chǎn)具有高含量生長因子和促進再細胞化和血管化所必需的基本成分的脫細胞支架，在生物降解前實現(xiàn)體內(nèi)建設(shè)性重塑。
4.2 肝支架制作的標(biāo)準(zhǔn)化
4.2.1 脫細胞
盡管在20世紀(jì)70年代和80年代首次報道了從組織中分離細胞外基質(zhì)(ECM)的嘗試，2008年Ott等人首次成功進行了整個器官脫細胞實驗他們通過向冠狀動脈灌注去污劑12小時，成功構(gòu)建了大鼠全心臟支架，這一成果標(biāo)志著全器官組織工程領(lǐng)域的重大突破。2010年，Uygun等人證明了通過在大鼠肝臟中灌注去污劑72小時，獲得全脫細胞支架的可行性。在用大鼠肝細胞進行再細胞化后，他們將再細胞化的肝臟異位移植8小時。對移植物進行檢查發(fā)現(xiàn)肝細胞能夠保持其正常形態(tài)和功能。此后，幾個研究小組報道了使用不同方法和試劑進行肝臟去細胞化。
4.2.1.1 脫細胞劑
盡管已經(jīng)采用了各種方法(包括物理、化學(xué)和酶處理或這些方法的組合)來進行肝臟脫細胞化(圖2)，很難將其中任何一種藥物視為一種理想的方法，能夠有效平衡組織細胞質(zhì)和核內(nèi)容物的消耗，以及能夠促進重新接種的細胞的附著、生長和分化所必需的結(jié)構(gòu)和生物活性ECM成分的保存。
4.2.1.1.1 化學(xué)方法
化學(xué)處理通常用于肝臟脫細胞化，包括離子、非離子和兩性離子洗滌劑、醇、酸、堿和低滲/高滲溶液。雖然化學(xué)藥劑在脫細胞和去除脫細胞組織中的免疫原性物質(zhì)過程中起著關(guān)鍵作用，但它們可能會造成ECM損傷并影響所得脫細胞組織的生物相容性。
4.2.1.1.1.1 清潔劑
十二烷基硫酸鈉(SDS)和TritonX-100分別是用于脫細胞的常用離子和非離子試劑。SDS可以通過破壞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用使蛋白質(zhì)變性并裂解細胞，而TritonX-100可以破壞脂質(zhì)-脂質(zhì)、脂質(zhì)-蛋白質(zhì)和DNA-蛋白質(zhì)相互作用，同時保留蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。因此，SDS可能會對ECM結(jié)構(gòu)產(chǎn)生負面影響，破壞蛋白質(zhì)成分(包括膠原蛋白)的結(jié)構(gòu)，而TritonX-100不會改變ECM蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而是對細胞產(chǎn)生影響。值得注意的是，研究表明，由于膠原纖維結(jié)構(gòu)的破壞和隱蔽抗原的暴露，經(jīng)SDS處理的ECM支架在植入后通常具有更高的反應(yīng)性。然而，一項研究報告稱，TritonX-100傾向于將DNA分解成更大的碎片，這可能會引發(fā)不良的組織重塑反應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)表明，雖然TritonX-100比SDS更好地保存了ECM蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但它仍可能因殘留DNA而帶來一些免疫原性風(fēng)險。
4.2.1.1.1.2 酸和堿
酸和堿可以溶解細胞的細胞質(zhì)成分，并通過催化生物分子的水解降解去除核酸物質(zhì)。0.1%濃度的過氧乙酸(PAA)是肝臟脫細胞和滅菌最常用的酸，但它對GAG、生長因子和ECM的機械特性有不利影響。Hussein等人證明PAA能夠高效地從薄肝切片中去除細胞物質(zhì)，并能夠?qū)χЪ苓M行消毒。經(jīng)過PAA處理后，脫細胞肝臟保留了56%的GAG含量。同樣，氫氧化鈉和氫氧化銨已與TritonX-100和SDS等洗滌劑結(jié)合使用，以對生長因子產(chǎn)生最小的有害影響來脫細胞肝臟這些堿性試劑可以在pH值高于11時分離DNA鏈，提取細胞成分，并且被認為與隨后的再細胞化過程具有細胞相容性。
4.2.1.1.1.3 醇類
醇類，包括乙醇和異丙醇，通常用于通過脫水組織并隨后裂解細胞來降解和消除組織中的脂質(zhì)。由于乙醇對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、抗酸菌以及親脂性病毒具有很強的殺菌作用，許多研究人員已使用乙醇對肝臟進行脫細胞和滅菌然而，基于乙醇的脫細胞方法存在組織固定、ECM超微結(jié)構(gòu)損傷、細胞蛋白沉淀等缺點沉淀后，這些蛋白質(zhì)不再可溶，無法洗掉，從而會在支架內(nèi)留下殘留的細胞蛋白。蛋白質(zhì)組學(xué)分析證實了這一點，該分析發(fā)現(xiàn)酒精處理后支架中殘留了大量細胞蛋白。
4.2.1.1.1.4 低滲/高滲溶液
高滲溶液(例如氯化鈉)和低滲溶液(例如Tris-HCl)由于滲透壓導(dǎo)致細胞收縮或腫脹，最終導(dǎo)致細胞裂解和細胞成分從細胞中去除。它們將抗原細胞殘留物分散到整個組織中，對ECM結(jié)構(gòu)和成分的破壞最小。這些溶液的主要優(yōu)點是易于從組織中洗掉，以及能夠去除其他殘留的脫細胞化學(xué)物質(zhì)，從而降低毒性并提高脫細胞組織的生物相容性。盡管高滲溶液能有效去除蛋白質(zhì)，低滲溶液能有效去除細胞核和DNA，但它們可能無法完全消除細胞殘留物，可能需要額外的處理來促進細胞碎片的去除。因此，它們與其他化學(xué)或酶試劑結(jié)合使用時可以改善肝臟脫細胞。Kobes等人報道，用低滲溶液連續(xù)攪拌小鼠肝臟，然后浸泡在TritonX中，可實現(xiàn)有效的脫細胞，掃描電子顯微鏡成像顯示沒有細胞，且結(jié)構(gòu)完整性得以保留，證實了這一點。
4.2.1.1.2物理方法
物理脫細胞技術(shù)利用溫度、壓力和其他物理特性來分解細胞膜，幫助從組織或器官中去除細胞。盡管這些技術(shù)毒性低，但它們通常無法完全消除所有細胞成分，導(dǎo)致脫細胞材料中殘留大量免疫原性細胞殘留物。因此，它們通常被用作輔助治療，以補充化學(xué)和生物制劑的作用，從而增強脫細胞過程的整體功效。
4.2.1.1.3酶法
使用核酸酶、胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶、分散酶、磷脂酶和膠原酶的酶處理是常用的脫細胞方法。盡管酶通過靶向細胞碎片或細胞基質(zhì)內(nèi)的特定鍵或相互作用去除細胞成分具有很高的特異性，但僅使用酶完全脫細胞整個器官仍存在挑戰(zhàn)。此外，酶的高成本也構(gòu)成了障礙，因為脫細胞大型肝臟需要大量的酶。此外，酶殘留物可能會對再細胞化過程產(chǎn)生負面影響，或刺激不良的免疫反應(yīng)因此，酶處理(特別是涉及核酸酶和胰蛋白酶)通常與化學(xué)洗滌劑結(jié)合，然后進行各種清洗循環(huán)，以實現(xiàn)肝臟脫細胞化。
4.2.1.2 脫細胞劑的應(yīng)用方法
這些試劑可通過浸泡攪拌或灌注的方式應(yīng)用。攪拌通常用于肝切片脫細胞，以優(yōu)化最佳脫細胞或滅菌試劑。對于全肝脫細胞，灌注是常用的技術(shù)。
4.2.1.2.1 浸泡和攪拌
浸泡和攪拌是一種相對簡單的脫細胞方法，常用于缺乏血管通路的薄組織和較小器官，例如食道、小腸粘膜下層、膀胱、血管、氣管、皮膚、角膜和神經(jīng)。該過程涉及將組織浸入化學(xué)或生物制劑中，同時對其進行持續(xù)的機械攪拌。這種方法可加速細胞破碎、脫離基底膜、去除細胞成分，確保均勻暴露于脫細胞試劑中，并在減少暴露于刺激性試劑的時間的情況下實現(xiàn)有效的脫細胞。
4.2.1.2.2 灌注
灌注是通過插管的內(nèi)在血管系統(tǒng)輸注化學(xué)或生物制劑，是去除肝臟等大而厚的致密器官細胞的理想方法。這種技術(shù)可確保脫細胞試劑在整個組織中均勻擴散和浸潤，便于清除細胞和核物質(zhì)?；诠嘧⒌拿摷毎夹g(shù)備受關(guān)注，因為它能完整地保留三維ECM結(jié)構(gòu)，這對于生產(chǎn)臨床規(guī)模的肝臟用于人體移植至關(guān)重要。此外，灌注保留了固有的血管網(wǎng)絡(luò)(門靜脈、肝動脈和肝靜脈)，這是在再細胞化過程中和體內(nèi)移植后在肝臟內(nèi)運輸營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣所必需的。此外，膽管樹在灌注脫細胞后仍能維持，只需膽管細胞重新灌注即可恢復(fù)功能。重要的是，灌注脫細胞的效率取決于多種因素，包括灌注途徑(肝動脈或門靜脈或下腔靜脈)、灌注方向(逆行或逆行)、灌注條件(控制壓力和流速)、灌注持續(xù)時間、脫細胞制劑的類型和濃度以及肝臟的大小。灌注條件不當(dāng)導(dǎo)致ECM損壞、需要血管插管、需要特定的灌注泵和復(fù)雜的流量控制裝置是灌注法的主要缺點。
4.2.2 交聯(lián)
在再細胞化過程中以及體內(nèi)移植后，脫細胞肝臟可能會發(fā)生分解過程，稱為“生物降解”，這會對ECM的生物力學(xué)強度產(chǎn)生負面影響。交聯(lián)劑已被成功用于增強酶抗性、基質(zhì)分解，并最終提高各種組織和器官的生物機械強度此外，交聯(lián)已被建議通過掩蓋膠原蛋白中存在的抗原標(biāo)記來最大限度地減少對移植脫細胞組織的潛在免疫反應(yīng)。戊二醛已被用作一種有效的交聯(lián)劑；然而，它有幾個并發(fā)癥，如細胞毒性和鈣化王等人利用天然交聯(lián)劑京尼平對豬肝進行交聯(lián)，然后用1%TritonX-100和1%SDS進行灌注脫細胞處理。他們通過在交聯(lián)的脫細胞肝臟上培養(yǎng)人內(nèi)皮細胞(EA.hy926)或原代大鼠肝細胞來檢查支架的生物相容性。京尼平交聯(lián)對原代肝細胞和內(nèi)皮細胞活力的抑制作用不顯著，而戊二醛交聯(lián)則表現(xiàn)出顯著的細胞毒性。將交聯(lián)支架植入大鼠部分厚度腹壁缺損模型后，京尼平處理的支架主要引發(fā)M2巨噬細胞表型反應(yīng)，而戊二醛處理的支架導(dǎo)致宿主組織重塑中斷和混合巨噬細胞極化特征。然而，盡管京尼平具有生物相容性和有效性，但由于支架經(jīng)京尼平處理后呈現(xiàn)深藍色，成本高，提取工藝復(fù)雜，京尼平的臨床應(yīng)用受到限制。
4.2.3 滅菌
脫細胞肝臟的終末滅菌是生物反應(yīng)器中細胞體外培養(yǎng)和最終體內(nèi)植入的先決條件。理想的滅菌劑/方法不僅應(yīng)有效殺死或去除微生物，還應(yīng)安全、易于使用，并且對支架的生物相容性、物理或生物活性的影響最小。因此，選擇滅菌劑/滅菌方法至關(guān)重要。乙醇、PAA、微酸性電解水、PAA/乙醇、輻射和抗生素已被用于脫細胞肝臟的滅菌在我們之前的研究中，我們比較了0.1%PAA、70%乙醇和微酸性電解水對脫細胞豬肝切片2小時的滅菌效果。SAEW和PAA均能有效地對支架進行滅菌，而不會影響膠原蛋白，而乙醇會降低膠原蛋白的含量，并且在補充有10%FBS的DMEM和哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基中孵育時不能有效地對支架進行滅菌。
4.2.4 評價制備的肝支架的標(biāo)準(zhǔn)
不同實驗室用于肝臟脫細胞的方案差異很大，目的是在去除細胞和核物質(zhì)的同時保留ECM結(jié)構(gòu)和生物活性，以避免支架在體內(nèi)移植后引起宿主反應(yīng)。要達到這種平衡，需要仔細優(yōu)化脫細胞方案，以有效去除細胞物質(zhì)，同時保留必要的ECM結(jié)構(gòu)和生物活性分子。不同的因素會影響這種平衡，包括脫細胞劑的選擇、濃度和治療持續(xù)時間。此外，脫細胞過程中施加的機械力(例如攪拌或灌注)應(yīng)精確控制，以盡量減少對ECM的破壞。對于商業(yè)化生產(chǎn)肝臟支架，應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)化、高效的脫細胞技術(shù)。脫細胞支架制備完成后，棕色會變成淺色或透明的白色；然而，這種顏色變化并不能保證支架的有效脫細胞。最初，Badylak和他的團隊根據(jù)對體內(nèi)重塑和免疫反應(yīng)的各種研究，提出了三個必要的標(biāo)準(zhǔn)來確保脫細胞效率。第一個標(biāo)準(zhǔn)是在用DAPI或蘇木精和伊紅(H&E)染色的切片中缺乏核物質(zhì)。第二個標(biāo)準(zhǔn)是ECM中的DNA耗盡，使用市售的dsDNA試劑盒定量，支架含有少于50ngdsDNA/mgECM干重。第三個標(biāo)準(zhǔn)是DNA片段長度應(yīng)小于200bp，通過凝膠電泳測定。DNA最初被用作脫細胞的間接測量標(biāo)準(zhǔn)，因為它很難去除。這種困難使其成為評估細胞從支架中去除的徹底程度的實用方法。但是，現(xiàn)在人們認識到DNA含量并不是脫細胞效率或支架安全性的有力指標(biāo)，因為FDA并不要求DNA含量規(guī)范，因為制造商提交了機密的產(chǎn)品安全數(shù)據(jù)。根據(jù)我們在脫細胞領(lǐng)域的經(jīng)驗，我們建議通過PCR、免疫染色或ELISA定量來評估alpha-Gal的缺失情況，以確認alpha-Gal已完全耗盡。此外，由于豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)存在人畜共患傳播的風(fēng)險，通過PCR確保脫細胞豬肝內(nèi)完全不存在PERV至關(guān)重要。此外，研究關(guān)鍵ECM成分(包括膠原蛋白、GAG和生長因子)的保留也同樣重要，這些成分對于維持組織的結(jié)構(gòu)完整性和生物功能是必不可少的。
4.3 實質(zhì)區(qū)域的重建
再細胞化是指將特定類型的細胞植入脫細胞組織中，以形成具有特定結(jié)構(gòu)和功能、模擬原始組織的工程化結(jié)構(gòu)。該過程包括兩個主要步驟：第一步是接種細胞，使它們分布到脫細胞肝支架內(nèi)的適當(dāng)位置。第二步是在生理條件下通過主血管用培養(yǎng)基灌注整個肝臟，以模擬體內(nèi)狀態(tài)。肝臟由異質(zhì)性細胞類型組成，包括肝細胞、膽管上皮細胞(膽管細胞)、內(nèi)皮細胞、星狀細胞、庫普弗細胞、祖細胞和未分化細胞。因此，構(gòu)建可移植且具有功能的生物工程肝臟需要這些不同的細胞不僅重新填充實質(zhì)空間，還需要重新填充血管內(nèi)壁、竇狀隙和膽道網(wǎng)絡(luò)。
在肝移植方面，一些研究表明，移植約20-30%的正常肝臟質(zhì)量即可為接受者提供足夠的功能。例如，體重70公斤的人需要大約840億個肝細胞才能達到至少30%的肝功能因此，從理論上講，脫細胞支架內(nèi)肝實質(zhì)的不完全重新植入可能就足夠了，因為重新植入的肝細胞可以在體內(nèi)增殖以填充實質(zhì)，.但該假說尚缺乏確鑿的證據(jù)。
4.3.1 細胞來源
4.3.1.1 原代肝細胞
原代人肝細胞由于具有較高的宿主相容性，是用于臨床的生物工程肝臟重建的首選。然而，原代人肝細胞很少可用，主要來源于廢棄的尸體肝臟樣本。此外，它們的壽命短、增殖能力差，并且肝臟特異性功能和形態(tài)的喪失很快。在不同的再細胞化試驗中，豬肝細胞已被探索作為原代人肝細胞的替代品。Yagi等人將原代豬肝細胞和灌注培養(yǎng)基以4mL/min的速度通過門靜脈重新接種到脫細胞豬肝中，氧分壓約為300mmHg。重要的是，他們報告說，到第7天，大約有47.8%的重新接種肝細胞凋亡。此外，他們觀察到與第4天相比，培養(yǎng)基灌注7天后的白蛋白免疫染色較低，這歸因于培養(yǎng)基流引起的剪切應(yīng)力。
4.3.1.2 人類肝細胞系
為了解決使用原代肝細胞的挑戰(zhàn)，腫瘤衍生的肝細胞系(如HepG2細胞)已被廣泛用于重新填充脫細胞肝臟的實質(zhì)空間。這種選擇受到青睞，因為它具有可用性、快速生長、低成本擴增以獲得足夠的細胞數(shù)量進行再細胞化以及分泌人類蛋白質(zhì)的優(yōu)勢。HepG2細胞可有效重新填充脫細胞大鼠、豬和人類肝臟，同時保留其功能和增殖能力。與未經(jīng)處理的豬肝相比，在對血管樹進行有效的再內(nèi)皮化并用肝素-明膠混合物涂覆后培養(yǎng)的HepG2細胞表現(xiàn)出更高的功能基因表達，包括白蛋白、低密度脂蛋白受體(LDLR)和CYP2E1，以及增加的白蛋白分泌。這強調(diào)了有效的再內(nèi)皮化在保護實質(zhì)細胞免受培養(yǎng)基灌注引起的剪切應(yīng)力和增強肝細胞功能方面的重要性。然而，從臨床角度來看，與原代肝細胞相比，HepG2細胞由于其致瘤性和缺乏正常的代謝特征(尤其是尿素生成)，并不是臨床應(yīng)用的好選擇。
4.3.1.3 人胎兒肝細胞
人類胎兒肝細胞(Hfh)因其增殖和功能能力而被視為再細胞化的替代細胞來源。重要的是，這些細胞沒有經(jīng)過基因改造，因此致瘤風(fēng)險低于肝癌細胞系或永生化人類細胞系。此外，不存在人畜共患病傳播風(fēng)險和異種肝細胞常見的免疫問題。經(jīng)過13天的灌注期后，人胎肝細胞與胎兒星狀細胞共培養(yǎng)，能夠重新植入脫細胞豬肝，其中70%的細胞對白蛋白染色呈陽性。有趣的是，隨著灌注期的延長，表達下降。免疫組織化學(xué)染色顯示甲胎蛋白(AFP)和CYP3A7表達降低，CYP3A4、細胞角蛋白(CK)-18和過碘酸-希夫(PAS)表達增加，表明隨著灌注的進行，Hfh有望成熟。使用人類胎兒肝細胞的主要挑戰(zhàn)在于其可用性、倫理問題以及胎兒細胞的功能成熟度不完全。
4.3.1.4 間充質(zhì)干細胞
間充質(zhì)干細胞(MSCs)可從骨髓和脂肪組織等不同來源獲得。自體間充質(zhì)干細胞因其可獲得性、可擴增性、安全性以及可能有益的免疫調(diào)節(jié)作用，被認為是肝組織工程中一種潛在的臨床相關(guān)細胞類型。Jiang等人通過門靜脈將來自小鼠骨髓的間充質(zhì)干細胞重新注入脫細胞小鼠肝臟，并在介質(zhì)灌注過程中誘導(dǎo)其向肝系分化。與在二維培養(yǎng)基中分化的細胞相比，脫細胞肝臟的三維環(huán)境支持間充質(zhì)干細胞的肝臟分化，表現(xiàn)為肝臟特異性基因和標(biāo)記蛋白的表達水平更高，糖原儲存、白蛋白分泌和尿素生成增加。
4.3.1.5誘導(dǎo)性多能干細胞
誘導(dǎo)性多能干細胞(iPSC)是一種多能細胞，可通過過度表達四種轉(zhuǎn)錄因子(Oct4/3、Sox2、Klf4和c-Myc)對人類或動物分化的成體細胞進行重新編程而產(chǎn)生。然后這些細胞可以重新分化為肝細胞樣細胞。Park等人從耳皮膚成纖維細胞中產(chǎn)生了豬iPSC，并使用溶解的脫細胞豬肝提取物將它們分化為肝細胞(iPSCs-Hep)，然后將iPSCs-Hep通過門靜脈重新植入脫細胞大鼠肝臟中，并在支架實質(zhì)內(nèi)良好分布，表現(xiàn)出將白蛋白和尿素分泌到灌注液中的能力。
4.3.2 再細胞化方法
將細胞重新植入脫細胞肝臟可通過直接注射到實質(zhì)或通過肝膽血管灌注實現(xiàn)。鑒于肝臟的主要血液供應(yīng)是通過門靜脈，門靜脈具有寬腔和廣泛的分支，因此后者通常用于肝細胞植入。Zhou等人進行了一項研究，比較了水牛大鼠肝(BRL)上皮樣細胞在實質(zhì)內(nèi)注射或門靜脈灌注后的再植入效率。他們將細胞注射到脫細胞大鼠肝實質(zhì)內(nèi)的10個位置或?qū)⑵渥⑷腴T靜脈。通過門靜脈輸注輸送的細胞導(dǎo)致植入率低(83.4%±5.2%)且接種細胞分布較差，而實質(zhì)注射導(dǎo)致植入率高(93.2%±4%)且24小時后細胞在實質(zhì)空間中的分布更好。這種差異歸因于重新接種的細胞傾向于阻塞門靜脈管腔并被沖出支架。
4.4 血管重建
在脫細胞過程中，內(nèi)皮細胞層通常與其他實質(zhì)細胞一起被去除。ECM成分，尤其是支架中存在的膠原蛋白，在與血流中的循環(huán)血小板接觸時可以刺激活化途徑。因此，在肝臟支架體內(nèi)移植后，預(yù)計血小板聚集和凝固會立即發(fā)生，這可能會阻礙器官的血液供應(yīng)并導(dǎo)致細胞死亡。因此，重建血管網(wǎng)絡(luò)是必要的，以使移植物能夠用宿主血液灌注，確保向生物工程器官的不同區(qū)域供應(yīng)營養(yǎng)和氧氣，據(jù)報道，一般來說，細胞只能在距離營養(yǎng)和氧氣源約1-3毫米的區(qū)域內(nèi)存活。氧供應(yīng)至關(guān)重要，通過動脈血(肝動脈)和靜脈血(門靜脈)在肝竇內(nèi)以約1.2nmol/s/106個細胞的速度混合，肝細胞需要氧，從而滿足氧需求并維持肝細胞的高代謝活動。考慮到這一點，內(nèi)皮化效率低下可能導(dǎo)致壞死性死亡，并伴有移植物性能不佳和潛在的排斥反應(yīng)。
雖然向現(xiàn)有血管中注入細胞因子是一種簡單的技術(shù)，依賴于細胞因子粘附在血管管腔表面的能力，但部分細胞因子滲出血管結(jié)構(gòu)外進入實質(zhì)組織、細胞在生理流動條件下脫落以及竇狀等微血管結(jié)構(gòu)的再內(nèi)皮化仍是實現(xiàn)脫細胞肝臟完全再內(nèi)皮化的障礙。因此，要防止血小板粘附和血栓形成，就必須提高再內(nèi)皮化的效果。
4.4.1 提高再內(nèi)皮化效率
大量研究探索了不同的藥物來促進EC粘附和/或增強細胞支架相互作用，以促進EC在脫細胞肝臟內(nèi)的附著、生長和增殖。這些藥物，如抗血栓劑、抗體、生長因子和/或ECM蛋白，通過各種機制發(fā)揮作用，如下圖所示圖3和圖4。
4.4.1.1 肝素
肝素是一種天然存在的高度硫酸化的糖胺聚糖，常用作抗血栓形成劑。在制備不同的生物材料時，表面固定化肝素可與EC上的血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)相互作用，阻止血小板粘附，從而改善涂層表面的血液相容性。Bao等人首先描述了肝素在大鼠肝臟支架中的固定作用，主要是為了減少體內(nèi)凝血，而不是提高再內(nèi)皮化效率。他們通過逐層自組裝技術(shù)用肝素預(yù)處理脫細胞肝葉，用大鼠肝細胞球體對其進行再細胞化，并將其植入肝切除率為90%的嚙齒動物模型的門靜脈系統(tǒng)中。移植后的移植物支持肝功能72小時，保留了肝細胞形態(tài)，延長了動物存活時間。此外，他們在另一項涉及臨床規(guī)模豬肝的研究中也采用了類似的方法，然后用大鼠原代肝細胞和HUVECs進行再細胞化。他們觀察到，肝素處理可有效防止生物工程肝臟在體內(nèi)植入后的血液灌注過程中出現(xiàn)血栓。
4.4.1.2 明膠
明膠是水解膠原蛋白得到的一種高分子量天然蛋白質(zhì)，具有良好的生物相容性和生物降解性。Meng等人在明膠水凝膠中灌注內(nèi)皮細胞，以改善脫細胞肝臟支架的再內(nèi)皮化。他們報告稱，與在羅斯威爾帕克紀(jì)念研究所(RPMI)培養(yǎng)基中灌注內(nèi)皮細胞相比，脫細胞肝臟支架中注入的內(nèi)皮細胞保留率明顯提高，從而使血管腔周緣覆蓋率更高。Hussein等人將肝素和明膠混合，在血管表面形成粘性表面，提高了脫細胞豬肝的再內(nèi)皮化效率(圖4)。此外，他們在脫細胞肝臟中共培養(yǎng)了HepG2細胞和內(nèi)皮細胞，并將其異位移植到豬體內(nèi)，觀察到與未涂層的肝臟支架相比，沒有明顯的血栓形成，肝細胞功能更好。
4.4.1.3 抗CD31抗體
有人研究了腎臟和肝臟血管表面的CD31抗體連接。Ko等人用CD31抗體預(yù)處理脫細胞豬肝支架，然后用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)固定。然后，他們將小鼠EC(MS1)注入門靜脈、肝動脈、肝上下腔靜脈和肝內(nèi)下腔靜脈。通過這種方法，血管結(jié)構(gòu)的管腔內(nèi)出現(xiàn)了排列整齊、分布均勻的心肌細胞，體外血液灌流時血小板的粘附性顯著降低(圖4)。異位移植到豬體內(nèi)后，再內(nèi)皮化的肝臟可維持宿主生理血流長達24小時。Kim等人在脫細胞大鼠肝臟上涂覆抗CD31合子或抗CD31抗體，然后在支架上播種HUVEC細胞并進行生物反應(yīng)器培養(yǎng)7天。如圖4所示，與抗CD31抗體相比，在抗CD31合劑涂層存在的情況下，可觀察到沿血管腔形成連續(xù)的內(nèi)皮，從而使整個肝臟構(gòu)建體的內(nèi)皮化更有效。
4.4.1.4 與ELP結(jié)合的REDV
Devalliere等人通過門靜脈注入與彈性蛋白樣肽(ELP)共軛的Arg-GluAsp-Val(REDV)，ELP可在熱觸發(fā)時聚合成融合蛋白，從而包裹脫細胞大鼠肝臟內(nèi)的血管，改善內(nèi)皮細胞的附著。ELP序列使生物聚合物具有原生彈性蛋白的機械特性，而REDV則通過靶向粘附受體α4β1整合素來增強附著力。值得一提的是，這些受體只存在于心血管細胞表面，而不存在于血小板上。REDV肽對心血管細胞的這種特異性親和力使其成為增強生物工程肝臟再內(nèi)皮化的絕佳候選物質(zhì)。Uygun和她的同事通過用REDV-ELP灌注脫細胞肝臟證實了這一點，結(jié)果顯示EC的附著、擴散和增殖顯著增加，血管壁上的內(nèi)皮單層也在生長(圖4)。此外，REDV-ELP共軛可減少富血小板血漿體內(nèi)外灌注時血小板的粘附和活化。
4.4.1.5 纖連蛋白
纖連蛋白是一種大型粘附性糖蛋白，被認為是脫細胞組織中的主要成分，已被廣泛用于與生物材料表面共軛，以加速EC的附著、擴散和分化。Watanabe等人研究了纖連蛋白與流動機械應(yīng)力相結(jié)合增強再內(nèi)皮化的能力。在通過門靜脈將HUVECs導(dǎo)入大鼠肝臟之前，先用纖維連接蛋白處理脫細胞大鼠肝臟。與2.4mL/min和9.4mL/min的灌注速度不同，4.7mL/min的灌注速度有助于竇狀規(guī)模微血管的生成。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，在4.7mL/min的灌注培養(yǎng)過程中，在脫細胞肝臟支架上加入纖連蛋白涂層可促進竇狀規(guī)模微血管的生成。然而，Watanabe等人的研究存在一個局限性，即作者沒有在體外血液灌流系統(tǒng)或體內(nèi)評估脫細胞肝臟內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)的血液相容性。值得一提的是，據(jù)報道，使用纖維連接蛋白等ECM蛋白有幾個缺點。例如，使用纖連蛋白可能會導(dǎo)致受體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。此外，固定蛋白在暴露于培養(yǎng)基時表現(xiàn)出高度不穩(wěn)定性和降解性。此外，纖維粘連蛋白具有很高的血栓形成潛能，當(dāng)涂覆纖維粘連蛋白的生物材料與患者體內(nèi)血液接觸時，可啟動凝血級聯(lián)反應(yīng)。
4.4.1.6 其他制劑
其他制劑，包括褐藻糖膠(FU)、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸(HA)、硫酸軟骨素、1型膠原和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，已被用于改善納米和金屬支架表面以及心臟瓣膜和血管等薄組織的內(nèi)皮化。這些制劑能與細胞內(nèi)皮相互作用，誘導(dǎo)粘附，并與血小板相互作用，降低血栓形成的風(fēng)險，從而有可能增強脫細胞肝臟內(nèi)的再內(nèi)皮化。要評估這些制劑在提高脫細胞肝臟支架再內(nèi)皮化效率方面的功效，還需要進一步的研究。
4.4.2 細胞來源
作為先決條件，用于血管重建的細胞應(yīng)該是非免疫原性的、能夠增殖產(chǎn)生大量細胞、易于收獲、并保留與天然血管中的內(nèi)皮細胞的功能。
4.4.2.1 成人EC
內(nèi)皮細胞在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中具有重要意義。然而，由于供體的多樣性、分離的技術(shù)挑戰(zhàn)、增殖能力有限、衰老和異質(zhì)性，其應(yīng)用受到限制。細胞系，包括HUVEC和EA.hy926細胞，由于其相對容易獲取、可以從醫(yī)療廢物中非侵入性地獲取，以及分離后的產(chǎn)量高，已被廣泛用于脫細胞肝臟的再內(nèi)皮化。這兩種細胞類型都能夠覆蓋脫細胞肝臟的血管，在體外血液灌注過程中血小板粘附和血凝塊形成顯著減少，并表現(xiàn)出在豬體內(nèi)移植后能夠承受血流的能力。主要缺點是它們的免疫原性和難以用作自體內(nèi)皮細胞來源。此外，HUVEC表現(xiàn)出植入不良、形成血管的能力有限以及在體內(nèi)應(yīng)用后無法長期存活。
4.4.2.2內(nèi)皮祖細胞
內(nèi)皮祖細胞(EPC)是源自骨髓的外周血循環(huán)細胞，約占所有血液單核細胞的0.01%，其中一些細胞存在于成人的脂肪組織中這使得能夠從外周血、脂肪抽吸組織和骨髓中輕松分離出足夠數(shù)量的自體EPC，為脫細胞肝臟的再內(nèi)皮化在臨床應(yīng)用中具有良好的潛力此外，有報道稱EPC比EC具有更高的血管生成潛力。周等人通過門靜脈向脫細胞大鼠肝臟注入從大鼠骨髓中分離的EPC。經(jīng)過3天的培養(yǎng)基灌注，重新接種的細胞覆蓋了脫細胞肝臟內(nèi)的血管結(jié)構(gòu)。
4.4.2.3誘導(dǎo)性多能干細胞
iPSC-EC可以通過多種方法從不同的細胞來源產(chǎn)生，具有優(yōu)異的增殖能力。當(dāng)將人類iPSC衍生的EC注射到斑馬魚模型中時，它們可以形成血管并與宿主血管吻合。Takeishi等人將人類iPSC分化為iPSC衍生的血管EC，并將分化后的細胞重新接種到大鼠脫細胞肝臟中細胞植入支架的血管結(jié)構(gòu)中，在類似器官的環(huán)境中表現(xiàn)出血管生成和抗凝相關(guān)基因和功能的增強表達。
4.5膽道重建
需要解決的挑戰(zhàn)之一是在生物工程肝臟內(nèi)重建功能性膽管系統(tǒng)。每天，健康的人類肝臟會產(chǎn)生約750毫升膽汁來幫助消化脂質(zhì)，其中肝細胞是其分泌的主要貢獻者，通過膽管傳遞到膽囊。
膽管細胞是膽管系統(tǒng)肝內(nèi)和肝外管道的上皮細胞，通過跨膜分子參與膽汁的形成、修飾和運輸。雖然這些細胞僅占肝細胞總數(shù)的約3%–5%，但它們對于維持不同的正常生理過程是必不可少的。此外，膽管細胞充當(dāng)細胞毒性膽汁和周圍組織之間的主動屏障。因此，在生物工程肝臟內(nèi)重建膽管網(wǎng)絡(luò)的肝內(nèi)和肝外膽管對于構(gòu)建功能齊全的肝臟器官和避免移植后并發(fā)癥嚴(yán)重的肝損傷至關(guān)重要。幸運的是，通過掃描電子顯微鏡、腐蝕鑄型、染料灌注和造影劑射線照相術(shù)證實膽管網(wǎng)絡(luò)樹在脫細胞后完好無損；只需用膽管細胞重建即可。
雖然已有多項研究報道了用肝細胞對去細胞化的肝臟進行再細胞化，但用膽管細胞對膽管進行再填充的試驗卻寥寥無幾。這可能是由于很難分離到足夠數(shù)量的膽管細胞，膽管細胞在經(jīng)過幾次傳代后會發(fā)生脫分化，在繁殖過程中會喪失功能和表型，以及膽道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)曲折復(fù)雜。
4.5.1 細胞來源
4.5.1.1 原代膽管細胞
Chen等人通過膽管注入原代膽管細胞、通過門靜脈注入肝細胞，對脫細胞大鼠肝臟進行再細胞化。重要的是，他們報告說，脫細胞肝支架內(nèi)的膽管系統(tǒng)幾乎不透水，且最小膽管末端封閉，使得注入肝外膽管的任何液體都能保留下來，而不會擴散到實質(zhì)中。因此，他們注入的膽管細胞量僅足以填滿膽管，然后進行1小時的靜態(tài)培養(yǎng)，使膽管細胞附著在膽管上。經(jīng)過48小時的動態(tài)灌注后，他們觀察到膽管上皮細胞形成管道狀結(jié)構(gòu)，而活肝細胞團則位于實質(zhì)空間中，其排列方式模仿天然組織。有趣的是，與僅由肝細胞重新接種的脫細胞肝臟相比，用膽管細胞和肝細胞重新細胞化的支架顯示出略高的累積白蛋白生成和尿素分泌水平。
4.5.1.2 胎兒肝肝母細胞
胎兒肝成肝細胞已被用作原代膽管細胞的替代品。Baptista等人證明了脫細胞肝臟能夠誘導(dǎo)胎兒成肝細胞分化為膽道和肝細胞譜系此外，Ogiso等人還證實，存在器官特異性細胞-ECM通訊，這種通訊可增強脫細胞大鼠肝臟中重新植入的胎兒肝細胞成熟為肝細胞和膽管細胞譜系，而無需在7天的動態(tài)灌注期間向培養(yǎng)基中添加任何促分化信號。
4.5.1.3 類器官
最近，類器官技術(shù)因其能夠分化、自組織和增殖，且具有高效穩(wěn)定的性能，同時又不喪失理想的膽管細胞表型，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顯示出了巨大的前景。這使得類器官成為膽管樹重建的有吸引力的細胞來源。2015年，Huch等人首次描述了從人類肝活檢中建立膽管細胞類器官。他們利用EpCAM從導(dǎo)管EpCAM+導(dǎo)管細胞中分選出肝細胞(EpCAM-)，并報告這些EpCAM+細胞發(fā)育成類器官的效率為28.4%。發(fā)育中的類器官表現(xiàn)出導(dǎo)管樣表型，表達膽管細胞標(biāo)志物(KRT7和KRT19)和祖細胞干細胞標(biāo)志物(Sox9和LGR-5)，具有高增殖能力。在此研究之后，已證明可以從肝外膽管、膽囊和膽汁中成功生產(chǎn)類器官這些類器官表現(xiàn)出膽管系統(tǒng)內(nèi)不同來源的膽管細胞之間的轉(zhuǎn)錄組和表型差異。
Tomofuji等人通過用肝導(dǎo)管類器官重新植入大鼠脫細胞肝臟，重建肝內(nèi)膽管體外培養(yǎng)灌注3-5天后，重新植入的類器官沿膽管壁植入，重建具有管腔結(jié)構(gòu)的膽管樹狀網(wǎng)絡(luò)，并表達膽管細胞標(biāo)志基因(圖5)，包括KRT19、Sox9、CFTR和Hnf1b，并維持干性標(biāo)記物(Lgr5、Prom1)的表達。這些研究共同證明，肝內(nèi)來源、肝外來源和膽汁來源的器官組織可以有效地重新填充脫細胞膽管，同時保留與體內(nèi)原發(fā)性膽管細胞非常相似的基因表達譜。
5.移植模型
體外評估和離體血液灌注系統(tǒng)使研究人員能夠研究重新植入的肝細胞和膽管細胞的功能，以及肝支架內(nèi)皮的完整性。然而，體內(nèi)移植研究在監(jiān)管層面上至關(guān)重要，因為它不僅要評估上述參數(shù)，還要評估潛在的炎癥和/或免疫反應(yīng)，更重要的是，還要評估生物工程肝臟的臨床應(yīng)用可行性。肝臟去細胞化后保留的血管結(jié)構(gòu)使小鼠、大鼠和豬有機會通過將移植物連接到受體血管，異位或原位移植生物工程肝臟。通常，肝支架中的門靜脈和肝下IVC分別連接到主動脈和IVC或腎動脈和腎靜脈。
5.1 嚙齒動物模型
嚙齒動物對于評估再生細胞的存活和功能、生物工程肝臟的凝血性和免疫原性非常有用，而且比大型動物更受歡迎，因為它們易于繁殖、飼養(yǎng)、成本更低且符合倫理道德。在過去的十年中，多個研究小組報告了將去細胞化的雪貂、小鼠和大鼠肝臟植入同種異體嚙齒動物體內(nèi)，并植入有/無內(nèi)皮細胞的肝細胞。Uygun等人將去細胞化的大鼠肝臟植入原代大鼠肝細胞。他們進行了單側(cè)腎切除術(shù)，并將移植的肝門靜脈和肝動脈分別與受體的腎動脈和腎靜脈吻合8小時。支架內(nèi)的再植細胞能夠保持功能、正常形態(tài)和支架內(nèi)實質(zhì)的位置。
在支架移植前誘發(fā)急性或慢性肝衰竭是了解生物工程肝臟全部功能的另一個重要步驟。Bao等人對大鼠肝臟進行了去細胞處理，逐層進行肝素沉積，并在支架上重新植入肝細胞。他們將支架移植到90%肝切除大鼠的門戶系統(tǒng)，持續(xù)72小時。與90%肝切除相比，移植的支架改善了肝功能，降低了血氨水平，并延長了存活時間。
Kim等人將納米氧化石墨烯交聯(lián)生物工程大鼠肝臟移植到分別由70%部分肝切除和硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝衰竭小鼠模型中。該模型使作者能夠驗證支架的體內(nèi)再生能力。嚙齒動物作為模型的缺點是腹部空間不足，阻礙了整個肝臟的移植。因此，這些研究僅在單側(cè)腎切除術(shù)后移植了一個或幾個肝葉。此外，雖然嚙齒動物模型可以初步預(yù)測移植肝臟內(nèi)的細胞功能、血管通暢性和移植物免疫原性，但由于大小和解剖結(jié)構(gòu)上的差異，此類動物模型的研究結(jié)果通常無法應(yīng)用于人體臨床。
5.2 大型動物模型
一般而言，豬的肝臟是首選，因為它們的肝臟在大小、解剖學(xué)和生理學(xué)等許多方面都與人類肝臟相似。因此，通過該模型，可以更現(xiàn)實地評估生物工程肝臟的功能、潛在的血栓形成性和免疫反應(yīng)，以及支架抵抗正常門靜脈血流和壓力產(chǎn)生的剪切應(yīng)力以及手術(shù)并發(fā)癥的能力。單側(cè)腎切除術(shù)為移植一個葉或整個生物工程肝臟提供了空間。由于不同的研究人員使用人類細胞對支架進行再細胞化或再內(nèi)皮化，因此需要使用免疫抑制劑。Barakat等人將豬去細胞右側(cè)肝葉輔助移植到受體豬體內(nèi)，并用甲基強的松龍進行免疫抑制。生物工程肝葉分別使用受體門靜脈和肝下腔靜脈作為流入和流出，植入肝下空間，據(jù)報道在移植2小時內(nèi)保持支架的完整性。Hussein等人用EA.hy926內(nèi)皮細胞對脫細胞豬右側(cè)肝葉進行再內(nèi)皮化，然后用HepG2細胞重新接種肝葉。他們將生物工程化的肝葉異位移植到豬體內(nèi)1小時，并報告說，對比X光檢查發(fā)現(xiàn)血管樹通暢，凝血標(biāo)志物表達下調(diào)，肝素-明膠預(yù)涂層肝支架中的肝功能表達增加。這項研究表明肝素明膠涂層在提高再內(nèi)皮化效率和維持體內(nèi)實質(zhì)細胞功能方面是有效的。
我們研究小組通過脾切除術(shù)和甲基強的松龍給藥在受體豬中誘導(dǎo)免疫抑制，然后移植用HUVEC重新內(nèi)皮化的脫細胞肝臟，如圖所示圖6。我們觀察到，與未進行免疫抑制的組相比，免疫抑制導(dǎo)致免疫反應(yīng)顯著降低，移植物灌注時間更長，移植物血管通暢時間超過14天。有趣的是，隨著免疫抑制的停止，移植物血栓形成的發(fā)生率與非免疫抑制組相似，這表明針對HUVEC的異種免疫反應(yīng)在血栓形成和移植物損失中起著關(guān)鍵作用。更進一步的是，在另一項研究中，我們成功地將原代豬肝細胞重新接種到之前用HUVEC重新內(nèi)皮化的脫細胞肝支架上。我們通過結(jié)扎原生門靜脈和肝動脈，原位切斷原生肝臟的血管。然后，將生物工程肝臟植入原生肝臟尾部的輔助位置。生物工程肝臟內(nèi)重新植入的肝細胞具有功能性，能夠產(chǎn)生白蛋白、解毒氨并合成尿素，最長可達48小時。
Higashi等人將去細胞化肝臟的右側(cè)葉重新植入原代肝細胞和內(nèi)皮細胞。通過脾切除術(shù)以及免疫抑制藥物(包括噻氯匹定、潑尼松龍和他克莫司)誘導(dǎo)受體豬的免疫抑制，并在術(shù)后期間進行免疫抑制。然后，將支架移植到60%肝切除的豬體內(nèi)，作為誘導(dǎo)肝衰竭模型，持續(xù)28天。重要的是，除了作為抗凝劑的肝素外，動物還接受了阿司匹林和噻氯匹定以防止血小板聚集。生物工程支架顯示出良好的肝細胞移植再植效果，肝功能得到改善，并表現(xiàn)出肝特異性基因的上調(diào)。值得注意的是，這項研究首次記錄了生物工程肝移植在臨床前大型動物模型中移植后28天的分析結(jié)果。
6. 監(jiān)管措施
到目前為止，F(xiàn)DA還沒有專門針對通過脫細胞和再細胞化方法聯(lián)合生產(chǎn)的生物工程肝臟器官的使用的具體指導(dǎo)方針。涉及再細胞化組織使用的監(jiān)管將與脫細胞組織相關(guān)的監(jiān)管類似，但會有一些針對細胞重新引入的額外因素。一般來說，這些生物工程肝臟的使用將受到與醫(yī)療器械、生物制劑、人體細胞、組織以及細胞和組織基產(chǎn)品(HCT/P)相關(guān)的更廣泛的FDA監(jiān)管。
首先，使用人類/動物肝臟以及人類細胞進行細胞再生的知情同意和倫理考慮必須符合監(jiān)管準(zhǔn)則。其次，去細胞器官的制造必須符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》(GMP)的規(guī)定，以確保去細胞后組織的質(zhì)量、安全性、一致性和有效性。在去細胞化肝臟支架中為有毒的去細胞化試劑設(shè)定可接受的限度對于遵守FDA法規(guī)至關(guān)重要。由于存在活細胞，因此實現(xiàn)絕對無菌可能并不可行，但嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施(包括對殘留污染物的評估和監(jiān)管)對于確保用于再細胞化和后續(xù)臨床應(yīng)用的去細胞化肝臟的安全性和有效性至關(guān)重要。第三，對去細胞化器官進行再植會帶來額外的復(fù)雜性和安全考慮。因此，監(jiān)管機構(gòu)需要詳細的細胞來源信息，包括捐贈者篩查以防止傳染病的傳播、完整的細胞特征描述、再細胞化過程的驗證以及再細胞化器官內(nèi)細胞存活性和功能的證據(jù)。對再植細胞和去細胞ECM的免疫原性和兼容性的評估對于確保細胞的適當(dāng)整合至關(guān)重要。第四，臨床前和臨床試驗對于提供安全性和有效性的額外證據(jù)至關(guān)重要。
7. 結(jié)論和未來展望
肝臟組織工程正在迅速發(fā)展，其宏偉目標(biāo)是徹底改變肝病學(xué)和肝移植領(lǐng)域。最近，三維生物打印已成為一種有前途的組織和器官構(gòu)建技術(shù)，可用于藥物篩選和潛在移植。Barranger等人利用CometChip技術(shù)構(gòu)建了HepaRG人肝細胞的3D模型，促進了毒理學(xué)和疾病研究。同樣，Vernetti等人率先提出了一種自組裝肝臟模型，用于生理、藥物安全和疾病研究此外，多項研究還探索了單獨使用脫細胞肝生物墨水或?qū)⑵渑c其他材料結(jié)合用于肝臟結(jié)構(gòu)的3D生物打印。該技術(shù)由于其精確的控制和在復(fù)雜結(jié)構(gòu)中均勻分布細胞的能力而表現(xiàn)出巨大的潛力。然而，肝臟生物打印在可移植的全功能肝器官中的應(yīng)用仍處于起步階段，需要進一步廣泛的開發(fā)和擴展。本綜述重點介紹了通過脫細胞和再細胞化生產(chǎn)肝移植物，特別是哺乳動物肝臟(人、豬)，因為該方法具有優(yōu)越的可擴展性和臨床應(yīng)用潛力。
自Uygun等人開創(chuàng)肝臟脫細胞與再細胞化技術(shù)以來的14年間，灌注脫細胞/再細胞化技術(shù)取得了重大進展。這一進展使得能夠創(chuàng)建具有完整血管內(nèi)壁的臨床相關(guān)的脫細胞/再細胞肝支架，為再生醫(yī)學(xué)帶來希望。盡管取得了這些進展，但將生物工程肝支架過渡到臨床移植試驗仍面臨若干挑戰(zhàn)，需要進一步研究和開發(fā)。此外，這些生物工程肝臟可以作為開發(fā)能夠暫時支持肝功能衰竭患者肝功能的設(shè)備的支架。例如，臨床試驗“Miromatrix外部肝臟輔助產(chǎn)品(miroliverELAP®)對急性肝功能衰竭成人肝臟支持的1期前瞻性研究”目前正在研究miroliverELAP®系統(tǒng)(一種體外支持的生物人工肝系統(tǒng))在治療急性肝衰竭方面的療效。
脫細胞肝支架的免疫原性仍然是主要問題，特別是由于在未使用免疫抑制的大型動物模型中的研究有限。免疫抑制藥物的使用，加上缺乏對生物工程肝臟的體內(nèi)長期評估，導(dǎo)致對ECM免疫原性的研究不切實際。盡管如此，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了來自各種來源(例如人真皮和肺動脈瓣、豬小腸、膀胱和真皮以及牛心包產(chǎn)品)的各種脫細胞組織支架用于臨床，表明在克服免疫相關(guān)問題方面取得了進展。這些支架的臨床批準(zhǔn)凸顯了這些脫細胞組織在支持人體組織再生方面的安全性、有效性和生物相容性，解決了人們對脫細胞ECM潛在免疫反應(yīng)的擔(dān)憂。不同實驗室的脫細胞方案各不相同，導(dǎo)致不同方案產(chǎn)生的肝臟成分也不同。因此，脫細胞技術(shù)和質(zhì)量評估的標(biāo)準(zhǔn)化，以確保支架內(nèi)不含任何細胞毒性劑以及消除異種和致病表位，以分別解決潛在的宿主免疫反應(yīng)和人畜共患病問題，是滿足實驗和臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)所必需的另一項挑戰(zhàn)。
在去細胞支架中重新植入功能性肝細胞至關(guān)重要。目前，已有多種技術(shù)和細胞類型被用于肝臟支架的再植。原代肝細胞的使用已經(jīng)顯示出可重復(fù)性，但僅顯示出初步的重要功能跡象，例如在我們的一個體內(nèi)研究中血清氨的暫時穩(wěn)定。由于具有獨特的性質(zhì)和潛在的治療功效，間充質(zhì)干細胞和誘導(dǎo)性多能干細胞在臨床應(yīng)用方面具有重大前景。
重建完整且有功能的內(nèi)皮細胞層也面臨挑戰(zhàn)，需要制定微毛細血管重建和均勻內(nèi)皮細胞覆蓋的策略。最后，膽道系統(tǒng)的重建和各種細胞類型的重新分布仍未得到解決，這凸顯了實現(xiàn)全功能肝臟替代品的復(fù)雜性。
未來的工作還必須解決后勤方面的挑戰(zhàn)，例如器官可用性、儀器要求、成本考慮以及監(jiān)管審批，以促進更廣泛的臨床轉(zhuǎn)化。合作研究有望徹底改變肝臟再生和移植，為需要救命干預(yù)的患者帶來希望。
原文信息
The title of the article is “Liver tissue engineering using decellularized scaffolds: Current progress， challenges， and opportunities”.
DOI:10.1016/j.bioactmat.2024.06.001
來源：Internet
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