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現(xiàn)在的細(xì)胞培養(yǎng)耗材大多數(shù)已經(jīng)采用了一次性提前滅菌和處理過的塑料，好處是不用清洗，用完就可以扔了。

1、 耗材的清潔

要清洗的通常是玻璃、金屬材質(zhì)的工具，例如裝緩沖液的玻璃瓶、過濾用的較大尺寸的適配器，因?yàn)橐磸?fù)多次使用，所以需要在使用完后清潔和滅菌。

以我之前所在的實(shí)驗(yàn)室為例，用完的玻璃器皿需要先泡酸，過夜后取出，在自來水下沖洗掉酸之后，加清潔劑并用刷子里里外外刷干凈，清潔劑不能加多，不然泡沫太多看不清是否有污漬殘留。

完事之后再用自來水沖洗13-15次，接著用三級(jí)純水或蒸餾水沖洗1-2次，最后再用二級(jí)或一級(jí)純水沖1次，完成后拿去烘干，最后才是滅菌。金屬材質(zhì)的器皿則直接從使用清潔劑清潔開始，不需要泡酸。

2、 耗材的滅菌&過濾除菌

在培養(yǎng)過程中，所有要接觸的設(shè)備、耗材、液體都要確保無菌，除菌的方法取決于該物品在高溫下的穩(wěn)定性。

可耐高溫的，例如金屬、玻璃或PTFE材質(zhì)的塑料，可以用干熱滅菌或蒸汽滅菌，耐高溫的液體用蒸汽滅菌，對(duì)溫度敏感的塑料可以用乙醇處理，對(duì)溫度敏感的液體依靠過濾除菌。

上述除菌方式，大家接觸最多的應(yīng)該是蒸汽滅菌和過濾除菌。蒸汽滅菌依靠的是高壓滅菌鍋，在壓力100kPa、121攝氏度、20分鐘的反應(yīng)條件下，完成滅菌過程。

滅菌鍋的操作比較簡(jiǎn)單，大家要注意的有幾點(diǎn)：

1、 待滅菌的物品，如果是玻璃瓶并裝了液體，滅菌前要擰松蓋子，不然可能會(huì)爆炸，滅菌結(jié)束后，冷卻完之后再擰緊蓋子；

2、 耐熱的液體可以蒸汽滅菌，例如瓊脂培養(yǎng)基、甘油、PBS；不耐熱的不能用這種方法，例如氨基酸、抗生素、蛋白或酶；

3、 蒸汽滅菌會(huì)產(chǎn)生水蒸氣的滲透，因此如果是塑料耗材，例如裝載吸頭的盒子，要用紙包裹好以后再滅菌。

對(duì)于上述提到的第2點(diǎn)，不耐熱的液體，我們可以依靠過濾除菌。

最常用到的工具就是這種針頭濾器，它的過濾原理是正壓過濾，濾器套在注射器頂部，依靠推壓套筒產(chǎn)生的壓力，把注射器內(nèi)的液體推向?yàn)V器，然后透過濾膜，微生物截留在濾膜一側(cè)，另一側(cè)出來的液體就是無菌的。

使用針頭濾器要注意2點(diǎn)：

1、 實(shí)驗(yàn)室的針頭濾器濾膜有不同的材質(zhì)，例如PES、PVDF、尼龍等，可以通過觀察濾器外包裝來確認(rèn)，有的供應(yīng)商會(huì)把濾器做成不同顏色，便于快速區(qū)分濾膜材質(zhì)，例如默克的濾器顏色對(duì)應(yīng)關(guān)系為：PES（綠）、PVDF（黃）、尼龍（紫）、PTFE（白）。

圖片來源：https://images.app.goo.gl/P3Ab2u3wxXWiGJ2GA

為什么要了解濾膜材質(zhì)呢，不同材質(zhì)的濾膜適用于不同的實(shí)驗(yàn)，有的溶液只能使用特定濾膜過濾，例如DMSO，不能用PES和PVDF膜過濾，要用PTFE膜，否則會(huì)把濾膜溶解。

2、 濾膜的孔徑尺寸分為0.22微米和0.45微米，如果是為了過濾除菌，要選擇0.22微米的孔徑。

另一種過濾原理是負(fù)壓過濾，通常用于過濾大體積的溶液，例如培養(yǎng)基。

負(fù)壓過濾要依靠真空抽濾裝置，將瓶子內(nèi)的氣體抽走，造成一個(gè)負(fù)壓，而瓶口連接著濾器，濾器內(nèi)裝有待過濾的液體，這些液體就會(huì)被大氣壓壓向?yàn)V膜，過濾的液體直接儲(chǔ)存在瓶子內(nèi)。

像細(xì)胞培養(yǎng)中要用到的培養(yǎng)基，就可以通過這種方法來完成除菌，現(xiàn)在的培養(yǎng)基外包裝有瓶裝和粉劑，后者在配制好以后，就需要依靠負(fù)壓過濾完成除菌，瓶裝的則不需要。

不管正壓還是負(fù)壓過濾，濾膜的完整性是必須要關(guān)注的重要因素，如果濾膜破裂或穿孔，過濾除菌就無法實(shí)現(xiàn)。

如果判斷濾膜是否還正常，可以做起泡點(diǎn)測(cè)試，具體操作如下：在過濾時(shí)，當(dāng)所有液體都通過濾器以后，繼續(xù)提高壓力，此時(shí)濾膜的液體流出的那一側(cè)會(huì)在某個(gè)壓力下產(chǎn)生氣泡，這個(gè)是起泡點(diǎn)。

通常這個(gè)點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的壓力，是每款濾膜或針頭濾器的說明書標(biāo)注的“過濾壓力”的2倍多，如果起泡點(diǎn)在滅菌壓力（100kPa)時(shí)或更低時(shí)就出現(xiàn)，證明這個(gè)膜已經(jīng)穿孔了。那么過濾的液體都要視為非無菌的液體。