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一、原代細胞概述

指直接從活體組織或器官中分離并在體外培養(yǎng)的細胞，保留了與原組織相似的生物學特性和功能。這些細胞在培養(yǎng)中具有有限的增殖能力，但由于其高度的生理相關(guān)性，被廣泛用于研究細胞生理、疾病機制以及藥物篩選等領(lǐng)域。

二、原代細胞分離

將細胞從組織或器官中提取并進行體外培養(yǎng)的過程。具體步驟包括在無菌條件下獲取目標組織，利用酶如胰蛋白酶或膠原酶進行消化，將組織分解成單個細胞懸液，然后通過離心和過濾等方法分離出細胞，最終在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。

三、實驗步驟（消化培養(yǎng)法）

1、在無菌條件下，首先取大約1cm³的待培養(yǎng)組織，放入平皿或燒杯中，經(jīng)過多次用適量的Hanks溶液沖洗，去除血液殘留和結(jié)締組織。

2、用鋒利的剪刀將組織塊剪碎，得到約0.5mm × 1mm大小的小塊，并用Hanks溶液進行沖洗，使組織塊沉淀并棄去洗液。

3、將組織小塊吸入預(yù)先裝有無菌磁力攪拌子的錐形燒杯中，加入15~30ml的胰蛋白酶，然后用橡皮塞蓋緊，并用錫箔封好，置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)的電磁攪拌器上。

4、打開攪拌器，啟動攪拌子，關(guān)閉培養(yǎng)箱，使胰蛋白酶或膠原酶開始消化。在消化過程中，用顯微鏡觀察，檢查細胞是否分散成單個。若大多數(shù)細胞已分散，立即加入適量的Hanks溶液，終止消化。通常需10~20分鐘消化。

4、先用100μm不銹鋼篩過濾，濾去未消化的組織塊或大細胞團，然后用20μm不銹鋼篩過濾。

5、將濾液進行低速離心5分鐘（500轉(zhuǎn)），吸除上清液，并用Hanks溶液洗滌2次，最后加入含血清的培養(yǎng)液，搖勻，制成細胞懸液。

6、用計數(shù)板計數(shù)，確定細胞懸液的濃度，通常以1×105~3×105個細胞接種于培養(yǎng)皿中并放入培養(yǎng)箱（37攝氏度5%CO2）。

四、注意事項

1、組織塊在進行消化前需要進行2-3次漂洗，以去除組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。

2、漂洗可使用Hanks溶液或其他適當?shù)木彌_溶液，將組織塊置于漂洗液中，輕輕搖動或輕輕攪拌，使其中的離子和抑制物質(zhì)充分溶解和排出，然后將漂洗液棄去，準備進行下一步的消化處理。

3、胰蛋白酶是一種由胰臟分泌的消化酶其主要功能是水解蛋白質(zhì)，將復(fù)雜的蛋白質(zhì)分解為較小的多肽和氨基酸，這有助于身體吸收和利用蛋白質(zhì)。胰蛋白酶主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，從而使蛋白質(zhì)水解。

4、膠原酶則是一種來源于細菌的酶，在消化系統(tǒng)中具有強大的膠原水解作用。膠原酶能夠有效地分解膠原蛋白，因此在醫(yī)學上常被用于消化纖維性組織、上皮組織甚至癌組織。

5、適當提高原代培養(yǎng)接種的細胞密度，為培養(yǎng)細胞提供更多與體內(nèi)相似的細胞間相互作用，可大大提高原代培養(yǎng)細胞在體外的存活率。