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摘 要： 通過高分辨質(zhì)譜的測定與密度泛函理論方法的計算，揭示咖啡酸電噴霧負離子模式質(zhì)譜的奇電子離子產(chǎn)生過程與機理?？Х人崛ベ|(zhì)子分子裂解產(chǎn)生3個奇電子離子，分別為咖啡酸質(zhì)譜裂解的第三代產(chǎn)物離子m/z 134 （C8H6O2）、第四代產(chǎn)物離子m/z 108 （C6H4O2）和m/z 106 （C7H6O）。m/z 134離子來自于其前體離子m/z 135 （3，4-二羥基苯乙烯離子）羥基O—H鍵的直接均裂，因其裂解過程較m/z 135的其他裂解相對簡單并且所需能量相對較少，使質(zhì)譜中m/z 134峰強度較大。m/z 108與m/z 106離子的前體離子可以是偶電子離子m/z 109 （鄰苯二酚離子）和m/z 107 （2-羥基環(huán)戊二烯離子），也可以是奇電子離子m/z 134。m/z 108與m/z 106離子來自于偶電子離子時，m/z 109的O—H鍵直接發(fā)生均裂，m/z 107離子的O—H鍵經(jīng)過渡態(tài)發(fā)生均裂。

關(guān)鍵詞： 咖啡酸； 質(zhì)譜裂解； 量子化學計算； 奇電子離子

 

咖啡酸的化學結(jié)構(gòu)為3，4-二羥基苯丙烯酸，又稱作3，4-二羥基肉桂酸?？Х人嵋詥误w、多聚體或脂和苷的形式存在在于咖啡、茶，葡萄酒及蜂膠中[1?2]?？Х人峋哂酗@著的抗氧化作用[3]，同時還具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、神經(jīng)保護、抗焦慮、抗增殖和抗炎等多種生物活性[4?6]。質(zhì)譜分析技術(shù)由于其對各種復(fù)雜體系的突出的檢測能力，近年來應(yīng)用愈加廣泛和豐富?，F(xiàn)今在多樣質(zhì)譜分析技術(shù)中，軟電離質(zhì)譜技術(shù)占有主要地位，其中尤以電噴霧質(zhì)譜最為突顯。雖然軟電離質(zhì)譜較經(jīng)典的硬電離質(zhì)譜即電子電離質(zhì)譜具有一些優(yōu)點，但在化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律的成熟與完善方面與電子電離質(zhì)譜相比存有很大的差距，大量的化合物軟電離質(zhì)譜裂解的機理還有待發(fā)現(xiàn)。

咖啡酸的電噴霧多級質(zhì)譜的分析多年來一直受到關(guān)注[7?9]。雖曾運用量子化學計算探索過咖啡酸質(zhì)譜裂解機理，但也只就低分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過相對易行的結(jié)構(gòu)優(yōu)化與鍵斷裂能計算來解釋其部分質(zhì)譜特征[10]。多數(shù)化合物電噴霧質(zhì)譜，由于“偶電子規(guī)則”的作用，通常產(chǎn)生的是偶電子離子碎片?？Х人岬碾妵婌F負離子模式質(zhì)譜中有3個奇電子離子碎片，與相鄰的偶電子離子質(zhì)量僅相差1個氫原子。質(zhì)譜碎片離子違反“偶電子規(guī)則” (即電子離子經(jīng)碰撞活化后發(fā)生自由基碎裂反應(yīng)，產(chǎn)生奇電子離子)的現(xiàn)象，雖然有多個化合物的報道[11?12]，但偶電子離子失去1個氫原子生成奇電子離子的質(zhì)譜裂解卻較為罕見[13]。為了揭示咖啡酸質(zhì)譜這一特征的成因，筆者運用量子化學密度泛函方法，通過對咖啡酸的高分辨多級質(zhì)譜有關(guān)裂解反應(yīng)過渡態(tài)與碎片離子結(jié)構(gòu)的計算來解讀咖啡酸負離子模式相應(yīng)的裂解機理，展現(xiàn)咖啡酸質(zhì)譜奇電子離子碎片的生成途徑與其質(zhì)譜特征的來源。

 

1、 實驗部分

 

1.1 主要儀器與試劑

四級桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀：Thermo ScientificTM Q-ExactiveTM組合型，美國賽默飛世爾科技公司。

氮氣發(fā)生器：TMO-NM-35C型，英國PerMuta科技有限公司。

咖啡酸對照品：質(zhì)量分數(shù)為99.0%，大連美侖生物科技有限公司。

甲醇：色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司。

高純氮氣：體積分數(shù)為99.999%，哈爾濱黎明氣體有限公司。

氮氣：體積分數(shù)為99.9%，由氮氣發(fā)生器制備。

咖啡酸溶液：1 μg/mL，稱取咖啡酸對照品適量用甲醇溶解、稀釋。

1.2 儀器工作條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：負離子模式；噴霧電壓：3.2 kV；氣化溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：320 ℃；鞘氣：氮氣，壓力為206.85 kPa，流量為5 L/h；輔助氣體：氮氣，壓力為68.95 kPa，流量為5 L/h；吹掃氣壓力：68.95 kPa；源內(nèi)誘導解離(SID)能量：0～100 eV；碰撞氣體：高純氮氣；碎裂模式：高能碰撞誘導解離(HCD)；碰撞能量：10～200 eV；離子掃描范圍：m/z 50～185；循環(huán)記錄數(shù)：3次；四級桿隔離窗：m/z 1。

1.3 實驗步驟

取預(yù)先制備的1 μg/mL咖啡酸溶液，通過注射泵注入ESI源，注射流量為15 μL/min。于設(shè)定的質(zhì)譜參數(shù)下，根據(jù)咖啡酸的分子質(zhì)量獲取咖啡酸電噴霧負離子模式的二級質(zhì)譜，在測得的二級質(zhì)譜中確定質(zhì)荷比最大的碎片離子作為目標離子。獲取三級質(zhì)譜時，先對樣品進行不同能量的SID并記錄相應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。然后根據(jù)測定結(jié)果，在目標離子強度最大的裂解能量下重復(fù)實施SID，選取目標離子進行HCD，記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)。

1.4 計算與分析

密度泛函理論方法采用的交換關(guān)聯(lián)泛函/基組為RB3LYP/6-311G，輕、重原子均加極化函數(shù)與彌散函數(shù)。結(jié)構(gòu)優(yōu)化、振動頻率與其他計算均通過高斯09軟件完成。前體離子、中間體離子，產(chǎn)物離子和脫除的中性分子結(jié)構(gòu)判定的標準為結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，結(jié)構(gòu)振動頻率無虛頻。閉殼電子結(jié)構(gòu)的偶電子離子O—H鍵斷成開殼電子結(jié)構(gòu)的奇電子離子時，或以前體離子鍵伸長過程單線態(tài)基態(tài)與三線態(tài)激發(fā)態(tài)的交叉點作為過渡態(tài)[14]，或是以前體離子與總產(chǎn)物的熱焓差作為O—H鍵的鍵斷裂能[15?16]。偶電子離子之間的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)要求僅有單一的振動虛頻，并經(jīng)內(nèi)稟反應(yīng)坐標(IRC)計算分別能夠與前體離子及產(chǎn)物離子相連接。能量計算時采用電子與吉布斯自由能總和，能量單位選用kJ/mol。

依據(jù)質(zhì)譜測定結(jié)果計算各離子間的質(zhì)量與化學組成的差值，并結(jié)合相應(yīng)的中性丟失明確離子間可能的聯(lián)系，即確定各可能的中性丟失時相應(yīng)的前體離子與產(chǎn)物離子。以咖啡酸最穩(wěn)定的去質(zhì)子分子為起點[10]，根據(jù)質(zhì)譜的中性分子丟失、計算所有能發(fā)生途徑的過渡態(tài)與相應(yīng)過渡態(tài)下的中間體和產(chǎn)物離子，進而通過比較分析選出最為可能的裂解路徑與產(chǎn)物離子。以選出的產(chǎn)物離子作為前體離子按上述方法計算分析優(yōu)選出下一級裂解路徑與下一級產(chǎn)物離子，直至得到咖啡酸質(zhì)譜裂解的全部的奇電子離子。

 

2、 結(jié)果與討論

 

2.1 質(zhì)譜與奇電子離子

咖啡酸的電噴霧負離子模式多級質(zhì)譜見圖1。圖1(a)為m/z 179的二級質(zhì)譜，圖1(b)為m/z 135于SID 42 eV，HCD 100 eV時獲取的三級質(zhì)譜。

圖1   咖啡酸質(zhì)譜圖

Fig. 1   Mass spectrums of caffeic acid

由圖1(a)可知，咖啡酸的負離子模式質(zhì)譜主要由強度較大的碎片離子m/z 135、134及89離子和多個強度很小的離子組成。其中m/z 135離子強度最大；強度小的離子中有4個離子質(zhì)荷比數(shù)值(109、108，107、106)依次相差接近于1。由圖1(b)可知，除m/z 135離子外，咖啡酸二級質(zhì)譜中的其他碎片離子均直接或間接來自于m/z 135的碎裂。值得注意的是，在測定條件下碎片離子中有3個奇電子離子，即m/z 134、108、106離子，它們與鄰近的偶電子離子間在元素組成僅相差1個氫?？Х人岬碾妵婌F負離子模式質(zhì)譜中與奇電子離子生成相關(guān)的離子與元素組成見表1。表1中，去質(zhì)子分子記為M，碎片離子按質(zhì)量由大到小分別記為A至F；各離子測得的質(zhì)量與理論質(zhì)量的差值均小于5×10-6 Da。

表1   咖啡酸質(zhì)譜中離子質(zhì)量與元素組成

Tab. 1   The mass data and elemental compositions of each ion in caffeic cid mass spectrometry

 

2.2 裂解途徑與機理

2.2.1 裂解路線

圖2為負離子模式下咖啡酸的質(zhì)譜裂解產(chǎn)生奇電子離子的路線示意圖。在圖2中，質(zhì)譜裂解過程中脫除的中性部分與所需的最低能量值標注在前體離子與產(chǎn)物離子的連線兩側(cè)?？Х人豳|(zhì)譜裂解的過程如下：去質(zhì)子分子M先脫羧生成第二代產(chǎn)物離子A (3，4-二羥基苯乙烯負離子)，而后，A分別脫氫原子，脫乙炔和脫一氧化碳裂解成咖啡酸質(zhì)譜的第三代產(chǎn)物離子B、C和E。第三代產(chǎn)物離子B可分別脫乙炔和脫一氧化碳生成第四代產(chǎn)物離子D和F；第三代產(chǎn)物離子C和E也可失去氫原子分別生成四代產(chǎn)物離子D和F。

圖2   咖啡酸質(zhì)譜裂解路線示意圖

Fig. 2   Proposed mass fragmentation pathway for caffeic acid

2.2.2 去質(zhì)子分子的脫羧

圖3為去質(zhì)子分子M的脫羧反應(yīng)示意圖(圖3及后面的裂解機理示意圖中括號內(nèi)的數(shù)值為過渡態(tài)、中間產(chǎn)物離子及總產(chǎn)物分別與各自前體離子之間的相對能量值)。去質(zhì)子分子M的脫羧的具體過程如下。先是M通過過渡態(tài)TSM-M1其羧基氫遷移到羧基的另一個氧原子上，生成中間離子M1，隨后M1羧基O—H鍵旋轉(zhuǎn)經(jīng)過渡態(tài)TSM1-M2生成中間離子M2，接下M2經(jīng)過渡態(tài)TM2-A羧基氫與負電荷分布較多的羧基α碳結(jié)合，連接α碳與羧基的C—C鍵斷裂脫去二氧化碳生成產(chǎn)物離子A。M的這一脫羧反應(yīng)為連續(xù)反應(yīng)、歷經(jīng)3個過渡態(tài)得以完成。脫羧反應(yīng)的前兩個過渡態(tài)的能壘較低，質(zhì)子遷移與鍵旋轉(zhuǎn)極易進行。脫羧的最后一個過渡態(tài)的能壘最大(176 kJ/mol)，在動力學上為反應(yīng)的決定步驟。

圖3   去質(zhì)子分子的脫羧反應(yīng)示意圖

Fig. 3   Decarboxylation reaction of deprotonated molecule

2.2.3 A(m/z 135)離子的裂解

咖啡酸質(zhì)譜中來自于去質(zhì)子分子的產(chǎn)物離子A (m/z 135)可分別按不同的路徑發(fā)生裂解，其中生成咖啡酸的第三代產(chǎn)物離子B (m/z 134)、C (m/z 109)和E (m/z 107)的3條路徑如圖4所示。

圖4   產(chǎn)物離子A的裂解路徑示意圖

Fig. 4   The scheme of product ion A dissociation routes

圖4所示路徑1下的產(chǎn)物B為奇電子離子，由其前體離子A的酚羥基O—H鍵直接均裂脫除氫原子后產(chǎn)生。路徑2是由A側(cè)鏈端的氫通過1，3遷移經(jīng)過渡態(tài)TSA-C脫除乙炔后成產(chǎn)物離子C (鄰苯二酚離子)的過程，其能壘為394 kJ/mol。路徑3存在兩個過渡態(tài)，最高能壘為377 kJ/mol。路徑3中，先由A經(jīng)過渡態(tài)TSA-A1酚羥基氫通過1，3遷移生成中間離子A1，然后A1經(jīng)過渡態(tài)TSA1-E脫去一氧化碳由六元環(huán)收縮成五元環(huán)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物離子E (2-羥基-環(huán)戊二烯離子)。3條路徑中，路徑1裂解過程不僅最為簡單，而且所需能量(313 kJ/mol)最低，使得其產(chǎn)物離子B在質(zhì)譜中的強度較大。

2.2.4 D(m/z 108)離子的生成

咖啡酸質(zhì)譜裂解的第四代產(chǎn)物離子E (m/z108)為一奇電子離子，可通過兩種方式生成，見圖5。

 

圖5   產(chǎn)物離子D的生成示意圖

Fig. 5   Formation scheme of the product ion D

生成離子D的第一種方式的前體離子為奇電子離子B。該方式的過程與由A生成C的過程相似，僅是有中間離子的產(chǎn)生。具體的過程如下。先是B側(cè)鏈端上的氫經(jīng)過渡態(tài)TSB-B1向苯環(huán)進行1，3遷移產(chǎn)生中間離子B1，隨后B1經(jīng)過渡態(tài)TSB1-D脫除乙炔生成產(chǎn)物離子D。該過程D生成的最大能壘為399 kJ/mol，總產(chǎn)物離子與前體離子B的能量差為124 kJ/mol。產(chǎn)物離子D的第二種生成反式的過程相對簡單，其前體離子為偶電子離子C；產(chǎn)物離子D由離子C的酚羥基O—H鍵直接發(fā)生均裂后生成。方式二的能壘為301 kJ/mol，總產(chǎn)物離子與前體離子C的能量差為265 kJ/mol。如將離子D的生成上溯到離子A時，這時產(chǎn)物離子D的生成過程可分別看作是離子A先均裂再脫炔的過程或離子A先脫炔再均裂的過程。由于產(chǎn)物離子D的前體離子B較另一前體離子C易于生成，而C卻較B更易裂解，所以難以斷定哪個過程比較容易進行。

2.2.5 F (m/z 106)離子的生成

咖啡酸的第四代產(chǎn)物離子F (m/z 106)同碎片離子E一樣，也為一奇電子離子，也可由兩種方式生成，見圖6。

圖6   產(chǎn)物離子F的生成示意圖

Fig. 6   Formation scheme of the product ion F

離子F的第一種生成方式的前體離子也是奇電子離子B。當離子B苯環(huán)上氧自由基碳的相鄰的兩個碳原子發(fā)生結(jié)合經(jīng)過渡態(tài)TSB-B2生成五元環(huán)結(jié)構(gòu)的中間離子B2，隨后B2經(jīng)過渡態(tài)TSB2-F脫除一氧化碳生成產(chǎn)物離子F。該方式的最大能壘為232 kJ/mol，總產(chǎn)物離子與前體離子B的能量差為59 kJ/mol。離子F第二種生成方式的前體離子E為偶電子離子，產(chǎn)物離子F是由前體離子E的酚羥基O—H鍵均裂脫除氫原子后產(chǎn)生。方式二的能壘為222 kJ/mol，總產(chǎn)物離子與前體離子E的能量差為190 kJ/mol。當上溯到離子A時，碎片離子F的生成過程分別是由A先均裂失氫再脫一氧化碳或由A先脫一氧化碳再均裂失氫。也同碎片離子D的生成一樣，難以推斷哪個過程更易生成產(chǎn)物離子F。

需要指出的是，在對E的羥基O—H鍵均裂計算時，可獲得單線態(tài)基態(tài)與三線態(tài)激發(fā)態(tài)的交叉點，因而E生成F的能壘值選用交叉點對應(yīng)結(jié)構(gòu)的能量。同為由偶電子離子O—H鍵均裂脫氫原子生成奇電子離子，離子B與離子D的生成不存在著單線態(tài)基態(tài)與三線態(tài)激發(fā)態(tài)的交叉點，而離子F的生成卻能獲得相應(yīng)的交叉點。這一差別的原因是由于離子B的前體離子A與離子D的前體離子C的酚羥基的鄰位都具有苯氧負離子，當前體離子的O—H鍵伸長氫原子離去時易與鄰近的苯氧負離子結(jié)合，從而難以形成單線態(tài)基態(tài)與三線態(tài)激發(fā)態(tài)的交叉點。

 

3 、結(jié)語

 

咖啡酸的電噴霧負離子質(zhì)譜中的m/z 135離子為咖啡酸質(zhì)譜裂解的第二代產(chǎn)物離子，m/z 134、109、107碎片離子為質(zhì)譜裂解的第三代產(chǎn)物離子，m/z 108、106碎片離子為裂解第四代產(chǎn)物離子。第二代產(chǎn)物離子m/z 135離子化學結(jié)構(gòu)為3，4-二羥基苯乙烯負離子，來自于咖啡酸的4位酚羥基失去質(zhì)子形成的去質(zhì)子分子的脫羧反應(yīng)。第二代產(chǎn)物離子m/z 135離子可經(jīng)多個途徑繼續(xù)裂解，其中的第三代產(chǎn)物離子m/z 134是由m/z 135離子的酚羥基O—H鍵均裂所產(chǎn)生。作為奇電子離子的m/z 134離子其質(zhì)譜峰強度大的原因是其生成的過程相對簡單并且所需的能量較低。第四代產(chǎn)物離子的奇電子離子m/z 108與m/z 106碎片離子，它們的前體離子可是偶電子離子也可是奇電子離子。碎片離子m/z 135與m/z 109的O—H鍵均裂失去氫原子時不存在單線態(tài)基態(tài)與三線態(tài)激發(fā)態(tài)的相交點。

 

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引用本文： 方芳，方舟，孫長海 . 咖啡酸負離子模式質(zhì)譜奇電子離子碎片的解析［J］. 化學分析計量，2024，33（10）：34. (FANG Fang, FANG Zhou, SUN Changhai. Analysis of odd electron ion fragments in caffeic acid negative ion mode mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(10): 34.)