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一、流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry）的基本概念

 

Flow:流動(dòng)的+cyto:細(xì)胞+metry:度量=流動(dòng)狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞的檢測(cè)

 

流式細(xì)胞術(shù)是一種利用激光和熒光檢測(cè)器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行快速、多參數(shù)、定量的分析方法。

 

二、流式細(xì)胞儀的組成和工作原理

 

1.液流系統(tǒng)：提供動(dòng)力，使單細(xì)胞在鞘液的包裹下在流動(dòng)狀態(tài)下經(jīng)過(guò)激光的檢測(cè)。

 

2.光學(xué)系統(tǒng)：細(xì)胞結(jié)合著熒光染料，經(jīng)過(guò)激光激發(fā)，產(chǎn)生光學(xué)參數(shù)。分為散射光信號(hào)和熒光信號(hào)。

 

3.電子系統(tǒng)：將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電子信號(hào)，進(jìn)行后續(xù)分析。

 

由于光學(xué)系統(tǒng)是流式細(xì)胞術(shù)中的重點(diǎn)，接下來(lái)我會(huì)對(duì)這部分記性能詳細(xì)的解讀。

 

首先是散射光信號(hào)：常用的兩個(gè)散射光信號(hào)是前向角散射光（Forward Scatter, FSC）和側(cè)向角散射光（Side Scatter, SSC），前者表示細(xì)胞的相對(duì)大?。ú皇蔷唧w大小），后者表示細(xì)胞的顆粒度（例如細(xì)胞當(dāng)中細(xì)胞器的多少和細(xì)胞表面的粗糙程度）。

 

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然后是熒光信號(hào)：我們?cè)谇捌跇颖緶?zhǔn)備階段，可以使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)樣本進(jìn)行染色，做多色分析。光學(xué)系統(tǒng)得到的熒光信號(hào)，可以反映該抗原的表達(dá)量。即，樣本中目的抗原的表達(dá)量越高，它能結(jié)合的熒光素偶聯(lián)抗體越多（在熒光染料強(qiáng)度相同的情況下），熒光信號(hào)就越強(qiáng)。

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但是在實(shí)踐中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻經(jīng)常會(huì)受到細(xì)胞的自發(fā)熒光、非特異性染色、熒光通道串色、儀器的電子擾亂等多個(gè)因素的干擾而出現(xiàn)偏差。為了避免這些難以避免的因素對(duì)熒光染料強(qiáng)度的干擾，研究人員提出了染色指數(shù)（Stain Index）這一概念。

 

這一概念只考慮了抗體克隆與質(zhì)量、熒光團(tuán)純度和質(zhì)量、目的細(xì)胞、激光線(xiàn)及其功率等因素。染色指數(shù)基本與熒光染料的強(qiáng)度呈正相關(guān)。在常見(jiàn)熒光染料當(dāng)中：PE＞APC＞FITC＞PerCP。

 

三、多色流式細(xì)胞術(shù)的熒光染料搭配原則及注意事項(xiàng)

 

1.根據(jù)機(jī)器配置選擇最亮的熒光染料

 

大多數(shù)流式細(xì)胞儀都有著兩個(gè)或多個(gè)激光器（在使用你的流式細(xì)胞儀之前，必須要先了解到你的流式細(xì)胞儀激光器的數(shù)量、檢測(cè)器的數(shù)量以及濾光器的類(lèi)型，流式細(xì)胞儀究竟能同時(shí)檢測(cè)多少顏色是由這幾點(diǎn)共同決定的），同時(shí)有著四種、五種甚至更多波長(zhǎng)可供選擇：

 

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多色熒光染料盡量選擇不同激光激發(fā)的染料。在同一激光激發(fā)的染料中進(jìn)行選擇時(shí)，優(yōu)先選擇熒光強(qiáng)度高的染料，以保證最佳分辨率，尤其是應(yīng)用于一些很難染色的抗原，例如某些轉(zhuǎn)錄因子時(shí)。

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2.平衡抗原表達(dá)量和染料熒光強(qiáng)度

 

多色流式檢測(cè)不同于單色流式檢測(cè)，在單色檢測(cè)時(shí)，我們可以隨意選用熒光強(qiáng)度強(qiáng)的染料，但在多色檢測(cè)時(shí)，由于要盡量在不同激光激發(fā)的染料當(dāng)中進(jìn)行選擇，如果要檢測(cè)的抗原較多，那么就難免會(huì)出現(xiàn)因?yàn)轭伾南拗?，我們不得不給某些抗原分配強(qiáng)度較弱的染料。

 

在這種情況下，熒光強(qiáng)度低的染料可以分配給表達(dá)量高的抗原，從而讓表達(dá)量低或未知的抗原或罕見(jiàn)細(xì)胞群被強(qiáng)度更高的熒光染料染色（例如PE或APC），以檢測(cè)到更高豐度。做到合理的配色，從而讓多種抗原的檢測(cè)信號(hào)既均衡又清晰。

 

3.使熒光染料的光譜重疊達(dá)到最小

 

我們?cè)趯W(xué)習(xí)流式細(xì)胞術(shù)之初，會(huì)經(jīng)常聽(tīng)到“補(bǔ)償”一詞。因?yàn)楫?dāng)兩種熒光染料的光譜重疊時(shí)，其信號(hào)會(huì)相互干擾，應(yīng)用熒光補(bǔ)償技術(shù)就是為了減少這種干擾。

 

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舉個(gè)例子：

 

在補(bǔ)償之前，在用藍(lán)光激發(fā)(488nm)后，F(xiàn)ITC染料的光譜主要在FITC特有的通道中被檢測(cè)到，但光譜尾部卻位于用于檢測(cè)PE染料的濾光片范圍內(nèi)。這些信號(hào)就成了PE通道中的假陽(yáng)性信號(hào)，也就是說(shuō)FITC陽(yáng)性的細(xì)胞將出現(xiàn)PE陽(yáng)性。

 

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為了去除這部分假陽(yáng)性，就需要進(jìn)行補(bǔ)償。用僅用FITC標(biāo)記的樣品（單陽(yáng)性樣品）（N色分析就需要設(shè)置N個(gè)單陽(yáng)性管）。然后可以在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行調(diào)節(jié)，直到在PE通道中看不到FITC信號(hào)。在補(bǔ)償之后，F(xiàn)ITC光譜僅在特定的FITC的通道中可以檢測(cè)到。

 

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但補(bǔ)償越大，補(bǔ)償后信號(hào)的分辨率就越低。因此由不同激光激發(fā)的染料時(shí)多色流式檢測(cè)的首選，但要檢測(cè)的指標(biāo)越多，這一規(guī)則和盡量選擇熒光強(qiáng)度高的染料的規(guī)則越容易沖突。因此，犧牲個(gè)別熒光染料的強(qiáng)度來(lái)平衡多個(gè)指標(biāo)檢測(cè)的準(zhǔn)確性是有必要的。

 

4.減少對(duì)細(xì)胞的活性和狀態(tài)的擾動(dòng)

 

流式細(xì)胞儀不但可探測(cè)細(xì)胞表面的熒光，也可探測(cè)細(xì)胞內(nèi)的熒光。因此，如果要檢測(cè)細(xì)胞表面的分子，一定要保證細(xì)胞的活性，還應(yīng)盡可能保持細(xì)胞靜止，通常在4度進(jìn)行操作。否則，熒光抗體進(jìn)入死細(xì)胞內(nèi)，會(huì)產(chǎn)生非特異結(jié)果。

 

5.避免串聯(lián)染料帶來(lái)的假陽(yáng)性

 

串聯(lián)熒光染料是指通過(guò)共價(jià)鍵的方式將兩種染料串聯(lián)，其中一種染料的發(fā)射光譜和另一種染料的激發(fā)光譜部分重疊，這會(huì)產(chǎn)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，使得供體的熒光強(qiáng)度比它單獨(dú)存在時(shí)要低得多（熒光淬滅），而受體發(fā)射出來(lái)的熒光卻大大增強(qiáng)（熒光敏化）。

 

結(jié)合我們?cè)谏厦嫣岬降?ldquo;使光譜重疊達(dá)到最小”，我們可以將串聯(lián)的兩種染料看作是一種新的發(fā)射光譜和激發(fā)光譜遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開(kāi)的染料，這種串聯(lián)染料就比傳統(tǒng)的單分子染料更有優(yōu)勢(shì)。