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分子克隆（基因克隆/DNA重組/載體構(gòu)建）技術(shù)是一種在分子水平上操作的技術(shù)，用于將特定的DNA片段從供體生物中分離出來，然后通過體外重組、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等方法，將其插入到適合的克隆載體中，并將重組克隆載體引入到合適的寄主體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制與擴(kuò)增?？梢詰?yīng)用于蛋白表達(dá)、病毒包裝、基因治療、細(xì)胞治療、mRNA疫苗、RNA干擾、細(xì)胞功能等研究。

具體操作流程：

一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動(dòng)合成，通過一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3'-OH末端，并以此為起始點(diǎn), 沿模板5'→3'方向延伸，合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。

（1）PCR反應(yīng)基本成分：

①模板DNA

基因組DNA上的某個(gè)基因或DNA片段；也可以是mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA鏈。

②引物

先由引發(fā)酶（一種特殊的RNA聚合酶）在DNA模板上合成一段RNA鏈，它提供引發(fā)末端被稱為引物，接著由DNA聚合酶從RNA引物3^端開始合成新鏈。

③dNTPs 

(dATP、dCTP、dGTP和dTTP) 是PCR反應(yīng)中靶DNA序列擴(kuò)增的原料。在PCR反應(yīng)中每種脫氧核苷三磷酸的濃度以50-200μmol/L為宜, 不能低于10-15μmol/L。

④DNA聚合酶

該片段具有聚合酶活性和3'→5'外切核酸酶活性, 能識(shí)別和消除錯(cuò)配的引物末端, 以校正復(fù)制過程中錯(cuò)配的核苷酸。

通過雙鏈DNA的高溫變性 (denaturation)，目的是要使雙鏈DNA完全解鏈成單鏈。引物與模板的低溫退火 (annealing) ，作用是使模板DNA單鏈或上一輪的反應(yīng)產(chǎn)物與引物相結(jié)合。適溫延伸 (extension)，引物延伸是DNA聚合酶將脫氧單核苷酸逐一地加到引物3'-OH末端, 依據(jù)模板序列合成一條互補(bǔ)新鏈的過程。這三步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)。每一循環(huán)中所合成的新鏈, 又都可作為下一循環(huán)中的模板。

（2）反應(yīng)體系（50ul體系）

（3）反應(yīng)程序：

二、線性化載體

在目標(biāo)載體質(zhì)粒上選取合適的位點(diǎn)進(jìn)行單酶切或雙酶切，對酶切后的載體進(jìn)行割膠純化。

環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構(gòu)型：

①當(dāng)其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)時(shí),稱之為共價(jià)閉合環(huán)形DNA（cccDNA）,這樣的DNA通常呈現(xiàn)超螺旋的SC構(gòu)型；

②如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu),另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個(gè)缺口時(shí),稱之為開環(huán)DNA（ocDNA）,此即OC構(gòu)型；

③若質(zhì)粒DNA經(jīng)過適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶切割之后,發(fā)生雙鏈斷裂形成線性分子（IDNA）,通稱L構(gòu)型。

線性化之后的質(zhì)粒比正常質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳中跑的慢。

三、純化PCR、酶切產(chǎn)物并連接

將反應(yīng)結(jié)束的產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好，目前有多種試劑盒可供選擇；

連接線性化載體和PCR產(chǎn)物，可根據(jù)DNA連接酶試劑盒說明書設(shè)置，對于較大的片段可以選擇4℃連接過夜。

四、細(xì)菌轉(zhuǎn)化

冰上解凍克隆感受態(tài)細(xì)胞（DH5α）；取重組產(chǎn)物，加至感受態(tài)細(xì)胞中，冰上靜置30min，42℃水浴熱激45s，迅速置于冰上2-3min；加入600μL LB液體培養(yǎng)基,37℃搖菌1h。

五、菌落PCR

用滅過菌的 10ul 小槍頭挑取單克隆白斑至滅菌水中，振蕩混勻。然后用正常的 PCR 反應(yīng)程序可。

PCR正常反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，選擇正確條帶的菌液加入對應(yīng)的培養(yǎng)基，37℃搖起來。

注意事項(xiàng)：

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

①所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

②PCR 試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水。

③試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

④PCR 的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

①冰上解凍感受態(tài)細(xì)胞：大腸桿菌經(jīng)過低溫（0度)預(yù)處理的低滲cacl2溶液，造成細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，即易與外源DNA相黏附并在細(xì)胞表面形成復(fù)合物。

②熱激轉(zhuǎn)化利用氯化鈣來產(chǎn)生富含鈣離子的環(huán)境，從而抵消質(zhì)粒DNA和細(xì)菌細(xì)胞膜之間的靜電排斥。溫度的急劇提高可以在細(xì)菌胞膜表面形成小孔，質(zhì)粒DNA就可進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。

菌落PCR

①在做菌落 PCR 的時(shí)候，每次都要做陰性、陽性對照，陽性對照可以用抽提好的質(zhì)?；蚧蚪M，這樣可以確定 PCR 主反應(yīng)液的配制沒有問題。

②菌落PCR反應(yīng)程序變性94℃4-5min即可保證外源DNA釋放出來。