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摘 要： 建立擴(kuò)散-吸收提取/離子色譜法檢驗血中氰化物。取1.0 mL血樣置于10 mL頂空瓶中，加入1.0 mL超純水混勻，再加入0.5 mL濃磷酸，放入裝有0.5 mL 0.25% NaOH溶液的2.0 mL進(jìn)樣瓶中，密封后于60 ℃加熱40 min，放冷30 min，擴(kuò)散-吸收完畢后抽取進(jìn)樣瓶內(nèi)溶液進(jìn)行分析，安培檢測器進(jìn)行檢測，以CN-保留時間定性，以外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。氰化物（以CN-計）檢出限為0.5 ng/mL，且質(zhì)量濃度在1～500 ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.99，加標(biāo)回收率為71.3%～84.8%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%（n=6）。該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于血中氰化物的定性定量檢驗。

關(guān)鍵詞： 法醫(yī)毒物學(xué)； 氰化物； 離子色譜； 安培檢測器； 擴(kuò)散-吸收

 

氰化物是廣泛應(yīng)用于工礦業(yè)的有毒化學(xué)物質(zhì)，屬于劇毒物，是危險化學(xué)品之一，包括氰化鉀、氰化鈉、氫氰酸等無機(jī)氰化物和雙異氰酸鹽、丙烯腈等有機(jī)氰化物，此外，桃、杏、枇杷、楊梅、櫻桃等核仁及木薯等都含有氰苷，在體內(nèi)分解也可產(chǎn)生氫氰酸，因此過量食用含氰苷的果仁可引起中毒，與氰化物相關(guān)的投毒、中毒案件也偶有發(fā)生。氰化物進(jìn)入人體后，可與線粒體中細(xì)胞色素C氧化酶里的Fe3+形成配位鍵，阻止其還原為Fe2+，使其失去傳遞電子的能力，細(xì)胞無法吸收氧氣而導(dǎo)致人體窒息死亡[1]。氰化物中毒血質(zhì)量濃度約為0.5 μg/mL，致死血質(zhì)量濃度約為1.0 μg/mL[2]，在體內(nèi)一般以氰根離子和硫氰酸鹽的形式存在。

目前對于氰化物的檢測主要有分光光度法[3?5]、化學(xué)法[6?7]、柱前衍生-氣相色譜法/質(zhì)譜法[8?10]等檢測方法，也有相應(yīng)的GA/T 930—2011《生物樣品中氰離子的氣相色譜法和化學(xué)檢驗方法》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但都存在易被干擾或靈敏度低或操作繁瑣等缺點，離子色譜法具有抗干擾力強(qiáng)、高靈敏等優(yōu)點從而被廣泛應(yīng)用，但研究基質(zhì)多為水[11?13]，雜質(zhì)較少，而且即便有對血液開展的研究，所采用的樣品處理方式也要么為乙醇沉淀蛋白[14]，沉淀不完全導(dǎo)致基線不平整，要么采用類似的擴(kuò)散法[16]，但擴(kuò)散裝置設(shè)計復(fù)雜、采用導(dǎo)管導(dǎo)入的方式，并且處理過程中要求禁止搖勻，導(dǎo)致回收率不高，為此，筆者研究設(shè)計了結(jié)構(gòu)簡單、反應(yīng)空間狹小的擴(kuò)散-吸收裝置，通過加酸后密封加熱，使氰化物轉(zhuǎn)化為氫氰酸(HCN)并逸出，再被NaOH溶液吸收，采用高靈敏度ED檢測器檢測吸收液中NaCN的處理過程，建立了對血液樣本中氰化物高選擇性、高抗干擾能力、高靈敏度的檢驗方法，為該類案件的偵破和訴訟提供技術(shù)導(dǎo)偵和理論支持。

 

1、實驗部分

 

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：ICS5000型，配AS-AP自動進(jìn)樣器，美國賽默飛世爾科技公司。

恒溫水浴鍋：HH-S4型，常州市金壇國勝實驗儀器制造有限公司。

渦旋震蕩儀：MS3基本型，廣州儀科科技有限公司。

超純水機(jī)：Milli-QR型，美國密理博公司。

玻璃頂空瓶：20 mL，帶聚四氟乙烯密封蓋和鋁帽，浙江賽恩斯科學(xué)儀器有限公司。

玻璃進(jìn)樣小瓶：2 mL，美國安捷倫科技有限公司。

CN-標(biāo)準(zhǔn)溶液：CN-質(zhì)量濃度為100 μg/mL，溶劑為0.1 mol/L NaOH水溶液，美國CATO公司。

濃磷酸：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%，色譜純，天津大茂化學(xué)試劑公司。

NaOH溶液：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%，美國賽默飛世爾科技公司。

乙酸鈉：色譜純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%，美國西格瑪公司。

無水乙二胺：分析純，國藥化學(xué)試劑股份有限公司。

空白全血：青島市中心血站。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

將100 μg/mLCN-標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋為1.0、0.1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于3 ℃保存，實驗中根據(jù)需要添加以上兩種溶液至測定所需的濃度；將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的NaOH溶液稀釋為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的NaOH溶液，作為吸收液使用。

1.3 色譜條件

色譜柱：AS7陰離子分析柱(250 mm×4 mm，10 μm，美國賽默飛世爾科技公司)，帶AS7陰離子保護(hù)柱(50 mm×4 mm，10 μm，美國賽默飛世爾科技公司)、安培檢測器；參比電極：Ag/AgCl；工作電極：Ag；柱溫：30 ℃；流動相：0.5 mol/L乙酸鈉-0.1 mol/L NaOH-0.5%(體積分?jǐn)?shù))乙二胺，流量為1 mL/min；進(jìn)樣體積：25 μL。

1.4 實驗步驟

取0.5 mL吸收液于2 mL進(jìn)樣小瓶中，備用；取1.0 mL血液樣品于10 mL頂空瓶中，加入1.0 mL水，再加入0.5 mL濃磷酸，以300 r/min渦旋震蕩5 s；再用鑷子將進(jìn)樣小瓶快速放入頂空瓶，緊接著用聚四氟乙烯密封蓋和鋁帽密封頂空瓶；頂空瓶于60 ℃水浴中加熱40 min，取出室溫放冷30 min；開蓋后用針管吸取進(jìn)樣小瓶內(nèi)液體進(jìn)行離子色譜分析。注意操作過程中頂空瓶內(nèi)液體與進(jìn)樣小瓶內(nèi)液體不要混合。裝置示意圖見圖1。

圖1   樣品處理裝置示意圖

Fig. 1   Sample processing device schematic diagram

 

2、 結(jié)果與討論

 

2.1 樣品處理條件的優(yōu)化

采用擴(kuò)散-吸收法進(jìn)行提取，將血液樣品置于實驗室常用的10 mL頂空瓶(外瓶)中，加水進(jìn)行稀釋，便于HCN的逸出，同時使血液內(nèi)氰化物與濃磷酸的反應(yīng)更完全，加熱時HCN擴(kuò)散至外瓶上部空間，然后被裝有吸收液的2 mL進(jìn)樣瓶(內(nèi)瓶)吸收，變?yōu)椴粨]發(fā)的氰化鈉，吸取內(nèi)瓶氰化鈉溶液進(jìn)行離子色譜分析。這與傳統(tǒng)的乙醇沉淀蛋白的方法[14]相比，無干擾雜峰、基線平滑、操作簡單。方法使用的吸收液為0.25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的NaOH溶液，換算成物質(zhì)的量濃度為0.1 mol/L，這與流動相中NaOH的濃度基本一致，可確保出峰更加穩(wěn)定，且0.5 mL吸收液可完全吸收血液中含量為μg/mL級的氰化物。

試驗優(yōu)化了水浴加熱溫度、加熱時間和放冷時間。取空白血分別加入CN-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液適量，配制成10、50、200 ng/mL的添加樣本，按1.4方法處理，考察加熱時間分別為10、20、30、40、50 min，加熱溫度分別為40、50、60、70 ℃和冷卻時間分別為10、20、30、40 min時的CN-色譜峰面積，以各優(yōu)化參數(shù)下CN-的最大峰面積為100%基準(zhǔn)計算其他條件的回收率，以回收率作為評價指標(biāo)，結(jié)果見圖2。

圖2   不同加熱時間、加熱溫度及冷卻時間時的色譜峰面積

Fig. 2   The chromatographic peak area at different heating time， heating temperature and cooling time

由圖2可見，(1) HCN沸點較低(只有25.7 ℃)，析出量隨著加熱溫度的升高而增加，60 ℃時析出量達(dá)到頂點，之后隨著溫度的進(jìn)一步升高，由于部分發(fā)生聚合反應(yīng)呈減小趨勢[15]，溫度大于80 ℃時血液蛋白會變性凝固，因此未考察80 ℃以上的情況，最終將加熱溫度設(shè)置在60 ℃。(2) HCN析出量隨著加熱時間的延長而增加，40 min時析出量達(dá)到頂點，之后隨著時間的延長，由于氣密性等問題逐漸降低，綜合考慮，將加熱時間設(shè)為40 min。(3)理論上放冷時間越久，HCN與NaOH吸收液反應(yīng)越徹底，通過試驗發(fā)現(xiàn)，30 min時吸收已達(dá)飽和，之后基本無變化，故靜置放冷時間以30 min為宜。

2.2 血液粘稠度的影響

在極濃、較濃、正常三種不同粘稠程度的血液中分別添加CN-標(biāo)準(zhǔn)工作液，配制成10、80 ng/mL的加標(biāo)樣品溶液，按1.4方法處理，考察了血液粘稠度對HCN逸出效率的影響，不同血液粘稠度是的色譜法面積如圖3所示。由圖3可見，較濃和正常粘稠度血液的逸出率相差不大，但極濃血液樣品的逸出效率比較低，這是因為粘稠度越高，血中的脂肪、磷脂等含量越多，可使紅細(xì)胞凝聚性增加，會阻礙HCN逸出，因此盡管方法中對血液樣品進(jìn)行了1倍的稀釋，但對于極其粘稠的血液來說稀釋倍數(shù)仍然不夠?？紤]極其粘稠的血液較為罕見，在滿足方法要求的基礎(chǔ)上，最終采取1倍稀釋的方式。

 

圖3   不同血液粘稠度時的色譜峰面積

Fig. 3   Chromatographic peak area at different blood viscosity

2.3 頂空瓶體積的考察

配10、50、200 ng/mL的加標(biāo)血液樣品各兩份，分別置于10、20 mL的頂空瓶中，按1.4方法操作，以最大色譜峰面積為100%基準(zhǔn)計算回收率，不同頂空瓶體積時的色譜峰面積見圖4。由圖4可以看出，頂空瓶體積越大，瓶內(nèi)HCN分散體積越大，相同的進(jìn)樣體積內(nèi)HCN的含量越低，從而導(dǎo)致回收率降低。由于這兩種規(guī)格的頂空瓶均為實驗室常用，小于10 mL的頂空瓶比較少見，因此在滿足實驗要求的基礎(chǔ)上未考察容量更小的頂空瓶，最終采用10 mL的頂空瓶。

圖4   不同頂空瓶體積時的色譜峰面積

Fig. 4   Chromatographic peak areas at different headspace bottle volumes

2.4 內(nèi)源性氰化物的影響

將10份不同人的空白血、取其中1份正常粘稠度的空白血加CN-標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，按1.4方法處理，和空白水、CN-標(biāo)準(zhǔn)工作液一起進(jìn)樣分析，考察色譜峰形、空白血中雜質(zhì)和內(nèi)源性氰化物對目標(biāo)物的影響。圖5為CN-的色譜圖。

圖5   CN-的色譜圖

Fig. 5   Chromatograms of CN-

受飲食影響，氰化物作為人體中的內(nèi)源性物質(zhì)而普遍存在，據(jù)文獻(xiàn)報道[16]，203份普通人血中氰化物質(zhì)量濃度最高值為42 ng/mL，平均值11 ng/mL，白酒中盡管含有微量氰化物(國家規(guī)定不大于8 ng/mL)，但有研究發(fā)現(xiàn)，196份飲酒血液樣本中平均質(zhì)量濃度為10.2 ng/mL，68份不飲酒血液樣本平均質(zhì)量濃度為13.0 ng/mL，因此飲酒對人體血液中氰化物含量無影響；另外人體血液中氰化物質(zhì)量濃度吸煙者約為41 ng/mL，不吸煙者約為16 ng/mL[17]，且血液腐敗也可產(chǎn)生氰化物[18]。通過圖5可以看出，CN-峰形良好(Rt=5.117 min)，不受血液雜質(zhì)的干擾；空白水中未檢出CN-，但空白血中檢出了內(nèi)源性的微量CN-，質(zhì)量濃度最低約為0.5 ng/mL，最高達(dá)58.4 ng/mL，平均為15.9 ng/mL，與報道基本相符，因此在確定最終定量結(jié)果尤其是遇到較低質(zhì)量濃度的樣品時，要考慮內(nèi)源性氰化物對數(shù)值的影響。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

取空白血，依次加入CN-標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200、500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4方法處理后進(jìn)樣。

分析系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以信噪比(S/N)為3的質(zhì)量濃度作為檢出限(LOD)，信噪比(S/N)為10的質(zhì)量濃度作為定量限(LOQ)，測得CN-的檢出限和定量限；以CN-色譜峰面積作為縱坐標(biāo)，CN-質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到的回歸方程為y=0.109 2x+0.239 8，r=0.995 75，LOD、LOQ分別為0.5、1.0 ng/mL。

2.6 加標(biāo)回收與精密度試驗

取空白血按1.4方法進(jìn)行處理分析，記錄空白血的色譜峰面積本底值(R0)；配制質(zhì)量濃度分別為10、50、200 μg/mL的加標(biāo)血液樣品，每種濃度配制6份，按1.4方法處理，分析CN-色譜峰面積(R1)；直接稀釋CN-標(biāo)準(zhǔn)工作液至以上濃度，按1.4方法同步操作，記錄CN-色譜峰面積(R2)，計算回收率，試驗結(jié)果見表1。

表1   加標(biāo)回收與精密度試驗結(jié)果

Tab. 1   Results of the recovery and the precision test

 

由表1可以看出，方法回收率為71.3%～84.8%，準(zhǔn)確度較好；測試結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.84%～3.09%，精密度較好，符合法庭科學(xué)中毒物檢測的要求。

 

3、 結(jié)語

 

建立了血液中氰化物的離子色譜檢測方法，通過擴(kuò)散-提取的樣品處理方式，可準(zhǔn)確定性定量，方法操作簡便、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高。經(jīng)驗證該方法的特異性、準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度、線性和回收率均滿足法庭科學(xué)中毒物檢驗的要求，但未考察加大血液稀釋倍數(shù)對極其粘稠血液回收率的改善，有待繼續(xù)研究。盡管國家已加大對氰化物的管控力度，但與此相關(guān)的中毒也偶有發(fā)生，該方法的靈敏度優(yōu)于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，不僅可用于生物樣品中氰化物的檢驗，在疾控、環(huán)境、化工等其他領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用前景。

 

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