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外泌體RNA的提取與普通細(xì)胞RNA提取的差別之處在于我們得把外泌體分離出來(lái)然后裂解外泌體才能獲取RNA。外泌體可以由體內(nèi)絕大多數(shù)活細(xì)胞產(chǎn)生，常見(jiàn)的外泌體RNA主要有細(xì)胞外泌體RNA、血清外泌體RNA等，這里我們以細(xì)胞外泌體為例，介紹外泌體RNA提取的實(shí)驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng)：

一、實(shí)驗(yàn)步驟

1、外泌體的分離

（1）細(xì)胞培養(yǎng)上清的收集與預(yù)處理

細(xì)胞培養(yǎng)上清收集：如果是從細(xì)胞培養(yǎng)上清中獲取外泌體，先培養(yǎng)細(xì)胞至合適的密度。

對(duì)于貼壁細(xì)胞，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2~3次，去除殘留的完全培養(yǎng)基（RPMI1640+FBS+PS）,更換為無(wú)外泌體血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24~48h。之后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，轉(zhuǎn)移至離心管中。

對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用PBS重懸后，轉(zhuǎn)移至無(wú)外泌體血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后收集上清。

（2）外泌體分離

目前分離外泌體常用的方法主要是超速離心法或者直接購(gòu)買(mǎi)試劑盒提取的方法。而試劑盒提取的原理主要也是參考試劑與外泌體結(jié)合、試劑沉淀外泌體等方法。下面主要介紹三種外泌體提取方法：

1）超速離心法是一種經(jīng)典的外泌體分離方法。將收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)移至超速離心管中，絕對(duì)配平。首先，以300×g離心10min，去除細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片；然后，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，以 2000×g 離心10min，進(jìn)一步去除細(xì)胞碎片和微囊泡；接著，將上清再轉(zhuǎn)移至超速離心管，以100000 - 120000×g離心60~90min，使外泌體沉淀在管底。小心棄去上清，用適量的PBS重懸外泌體沉淀。

2）沉淀法：即直接購(gòu)買(mǎi)試劑盒，利用一些沉淀試劑（ExoQuick等）來(lái)沉淀外泌體。按照試劑說(shuō)明書(shū)，將適量的沉淀試劑加入樣本中，混合均勻后，在4℃下靜置過(guò)夜。然后，離心（如1500×g,30min）收集沉淀，用PBS重懸。

3）免疫磁珠分離法：如果有外泌體特異性的抗體標(biāo)記的磁珠，將樣本與磁珠混合，使外泌體與磁珠結(jié)合。將離心管置于磁力架上，使磁珠（結(jié)合外泌體）吸附在管壁一側(cè)，棄去上清。用 PBS 洗滌磁珠-外泌體復(fù)合物幾次，然后通過(guò)一些方法（如加入洗脫緩沖液）將外泌體從磁珠上洗脫下來(lái)。

2、裂解外泌體分離RNA

通常購(gòu)買(mǎi)外泌體RNA提取試劑盒會(huì)存在外泌體結(jié)合柱和RNA吸附柱可以直接方便獲取外泌體RNA，然而普通的RNA提取方法也同樣適用于外泌體RNA的提取，例如TRIZOL法。

（1）柱式提取法：購(gòu)買(mǎi)專門(mén)用于RNA提取的柱式試劑盒。按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，一般先將裂解后的外泌體樣本加入到結(jié)合柱中，通過(guò)離心使 RNA 結(jié)合在柱上。然后，用洗滌緩沖液洗滌柱子，去除雜質(zhì)。最后，用洗脫緩沖液將 RNA 從柱上洗脫下來(lái)，收集洗脫液，即為提取的外泌體 RNA。

（2）TRIZOL法：該方法主要利用相分離的原理,向裂解后的外泌體樣本中加入等體積的Trizol試劑，充分混勻。室溫靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物充分裂解。然后，加入氯仿（Trizol體積的 1/5），劇烈振蕩15~30s，室溫靜置10min。之后，4℃，12000×g ，離心15min，溶液分為三層，RNA 在上層水相中。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，冰上沉淀10min。最后，4℃，12000×g離心10min收集 RNA 沉淀。配置75%濃度的乙醇洗滌RNA 沉淀2次，4℃,7500×g離心5min，小心棄去乙醇，在超凈工作臺(tái)中干燥RNA沉淀。最后，用適量的RNase-free水或DEPC水溶解RNA。

3、RNA 質(zhì)量檢測(cè)

通常我們使用分光光度計(jì)（如 Nanodrop）檢測(cè) RNA 的濃度和純度，觀察 A260/A280 和 A260/A230 比值。A260/A280 比值在 1.8 ~2.0 之間表示 RNA 純度較好，A260/A230 比值一般應(yīng)大于 1.5。另外，我們還可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳（如用 1% ~ 1.5%瓊脂糖凝膠）觀察 RNA 的完整性，值得注意的是，真核生物外泌體RNA主要為小RNA，如 miRNA 等，會(huì)出現(xiàn)較模糊的條帶分布在小于200bp的區(qū)域。

二、注意事項(xiàng)

（1）首先分離外泌體我們需要保證獲取的外泌體量足夠多，因此細(xì)胞密度一定要足夠，例如選擇使用大的培養(yǎng)皿（10cm）或者T75瓶培養(yǎng)細(xì)胞。加入適量的去外泌體血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24~48h之后收集細(xì)胞上清。

（2）利用超速離心法收集外泌體，我們要保證離心管絕對(duì)配平 ，必要時(shí)需要給 離心管進(jìn)行稱重。

（2）外泌體RNA提取過(guò)程中，我們要防止 RNA 降解。因此，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程要嚴(yán)格遵守?zé)o RNase的規(guī)范操作。使用的耗材（如離心管、槍頭）應(yīng)為無(wú) RNase 的產(chǎn)品，應(yīng)戴手套、口罩等，避免RNase污染。另外，提取過(guò)程盡量在冰上下進(jìn)行，如裂解和沉淀步驟可在冰上操作。

（3）外泌體RNA利用異丙醇沉淀或者用75%的乙醇清洗時(shí)，需要有技巧的擺放離心管的位置，防止沉淀不明顯吸取上清過(guò)程中丟棄RNA沉淀。