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嘉峪檢測網 2024-12-06 08:16
摘 要： 建立高效液相色譜法同時測定平喘合劑中芍藥苷、黃芩苷含量。以Agilent ZORBAX-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）為分析柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，芍藥苷、黃芩苷的檢測波長分別為232、278 nm。芍藥苷、黃芩苷的質量濃度分別在1.180～5.900、9.450～47.250 μg/mL范圍內與其色譜峰面積線性關系良好，相關系數均大于0.999。樣品平均回收率分別為99.83%、102.31%，測定結果的相對標準偏差分別為2.07%、1.29%（n=6）。該方法簡便、準確度高、專屬性好，可用于平喘合劑的質量控制。
關鍵詞： 平喘合劑； 高效液相色譜； 芍藥苷； 黃芩苷
平喘合劑為山東省中醫(yī)院兒科常用中藥院內制劑，是多年臨床實踐經驗的總結和積累，具有獨特的療效和臨床應用價值，由麻黃、苦杏仁、白芍、黃芩等14味藥組成，具有溫肺化痰，定喘，清里熱的功效，臨床上常用于外感風寒，內有里熱，咳喘哮鳴，痰壅氣促，無汗煩躁等癥。兒童體質特殊，病情變化迅速，臨床上安全有效可控的兒童治療藥物較少[1?3]，2022年，為更好滿足兒童用藥需求，山東省藥品監(jiān)督管理局、山東省衛(wèi)生健康委員會確定平喘合劑為全省可用于治療兒童季節(jié)性流感的中藥制劑，臨床實踐證實其在流感高發(fā)期間發(fā)揮了重要的作用，深受廣大患者的信賴。
2021年平喘合劑被收載入《山東省醫(yī)療機構制劑規(guī)范》(第一版第四冊)，但平喘合劑中藥味較多且為兒科常用藥，現行標準中只收錄單一化學成分的含量測定，未能全面有效的控制復方制劑的質量情況。相關研究表明[4]，建立多指標成分的含量測定方法能更全面的反映制劑的質量，而相同成分在不同的分析環(huán)境下其最大吸收波長不盡相同。在中成藥復方制劑的質量標準控制中，很多文獻報道了運用高效液相色譜法同時測定芍藥苷和黃芩苷的含量，但大都是選擇單一波長或《中華人民共和國藥典》中記載的波長，而相同成分在不同的分析條件、制劑環(huán)境中其最大吸收波長是不同的[5?8]。筆者以芍藥苷、黃芩苷為指標，對待測成分進行全波長掃描以獲得待測成分的最大吸收波長，同時首次采用高效液相色譜雙波長法對平喘合劑進行方法學考察并建立完整的含量測定體系，以確保臨床用藥的安全、有效和質量可控。
1、 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀：Agilent 1260Ⅱ型，二極管陣列檢測器(DAD)，美國安捷倫科技有限公司。
數控超聲波清洗器：KQ-250B型，昆山市超聲儀器有限公司。
電子天平：XPE205，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器公司。
乙腈：色譜純，安徽天地高純溶劑有限公司。
實驗用水：純凈水。
芍藥苷對照品：質量分數為97.2%，批號為110736-202246，中國食品藥品檢定研究院。
黃芩苷對照品：質量分數為97.2%，批號為110715-202223，中國食品藥品檢定研究院。
實驗用其他試劑均為分析純。
平喘合劑：批號分別為24022302、24022401、24022501，山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院。
1.2 色譜條件
色譜柱：Agilent ZORBAX-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；流動相：A相為乙腈，B相為0.1%（體積分數）磷酸溶液；洗脫方式：梯度洗脫，流量為1.0 mL/min，洗脫程序見表1；檢測波長：232 nm (芍藥苷)、278 nm (黃芩苷)；柱溫：25 ℃；進樣體積：10 μL。
表1 流動相梯度洗脫程序
Tab. 1 Gradient elution program of the mobile phase
1.3 溶液配制
混合對照品溶液：精密稱取芍藥苷對照品4.00 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至標線，搖勻，制得芍藥苷對照品儲備液。精密稱取黃芩苷對照品5.40 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至標線，搖勻，制得黃芩苷對照品儲備液。分別精密量取上述兩種對照品儲液各1 mL，置于同一25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至標線，搖勻，即得混合對照品溶液，其中芍藥苷、黃芩苷質量濃度分別為3.11、21.00 μg/mL。
平喘合劑樣品溶液：精密量取平喘合劑1 mL，置于25 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至標線，混勻，過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至標線，取續(xù)濾液，即得平喘合劑樣品溶液。
陰性樣品溶液：按平喘合劑處方中藥材比例及制備工藝，制備缺白芍及黃芩的陰性樣品，按平喘合劑樣品溶液方法配制。
1.4 定量方法
取混合對照品溶液、平喘合劑樣品溶液、陰性樣品溶液，按照1.2儀器工作條件測定，以色譜峰面積外標法計算芍藥苷及黃芩苷的含量。
2、 結果和討論
2.1 樣品提取條件的考察
取平喘合劑(批號24022302)為待測對象，進行了提取溶劑及提取方法的考察。
提取溶劑分別選擇甲醇、70%乙醇(體積比，下同)、50%甲醇對平喘合劑進行提取試驗[9?10]，結果表明，以70%乙醇為提取溶劑時，芍藥苷及黃芩苷的色譜峰峰面積較大，峰形及分離度較好，故采用70%乙醇為提取溶劑。
提取方法分別選擇直接定容法、超聲法、回流法進行提取試驗[11?12]，結果顯示，直接定容法與超聲法和回流法所得目標物質的色譜峰峰面積差別不大，直接定容法操作簡便快速，故選擇提取方法為直接定容法。
2.2 色譜條件的選擇
2.2.1 流動相的選擇
試驗參考《中華人民共和國藥典》2020版一部“白芍”及“黃芩”項下的含量測定方法進行流動相的優(yōu)選[13]，分別選用甲醇-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相對平喘合劑中芍藥苷、黃芩苷進行含量測定試驗考察[14?15]，結果發(fā)現，以甲醇-0.4%磷酸溶液和甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相時，雖調節(jié)比例及梯度能最終實現較好分離度，但重復進樣時對下一個樣品的分析有影響，有雜峰出現使得芍藥苷和黃芩苷的分離度達不到1.5，而乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相時芍藥苷、黃芩苷峰形和分離效果在重復進樣時都較好，因此選擇流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液。
2.2.2 檢測波長的選擇
采用DAD檢測器在220～400 nm波長下對芍藥苷、黃岑苷對照品溶液進行全波長掃描，結果見圖1。由圖1可見，芍藥苷、黃芩苷分別在232、278 nm處有最大吸收，因此選擇芍藥苷、黃芩苷的檢測波長分別為232、278 nm。
圖1 芍藥苷、黃芩苷光譜圖
Fig. 1 Spectrographs of Paeoniflorin and Baicalin
2.2.3 柱溫的選擇
將柱溫分別設置為25、30、35 ℃進行試驗。結果表明，當溫度在35 ℃時，色譜峰基線上漂不穩(wěn)；當溫度為30 ℃時，目標峰的分離度不佳；當溫度為25 ℃時，色譜峰基線平穩(wěn)且芍藥苷、黃芩苷的色譜峰峰形及分離度良好。
2.3 分析方法驗證
2.3.1 專屬性試驗
取芍藥苷、黃芩苷混合對照品溶液、平喘合劑樣品溶液、陰性樣品溶液，在1.2色譜條件下分別進樣檢測，芍藥苷、黃芩苷混合對照品溶液、平喘合劑樣品溶液分別在其相同的保留時間處有同一色譜峰，陰性樣品溶液中無相應的色譜峰，表明該方法專屬性良好。上述溶液色譜圖如圖2所示。
圖2 芍藥苷、黃芩苷混合對照品溶液、平喘合劑樣品溶液、陰性樣品溶液色譜圖
Fig. 2 Chromatograms of paeoniflorin and baicalein mixed standard solution， Pingchuan sample solution， and blank sample solution
2.3.2 線性關系考察
用自動進樣器依次吸取混合對照品溶液1、2、3、4、5、6 μL注入高效液相色譜儀，分別測定峰面積。以對照品的質量濃度x為橫坐標，峰面積y為縱坐標，分別繪制芍藥苷及黃芩苷的標準曲線，計算線性方程和相關系數。
取芍藥苷對照品溶液、黃芩苷對照品溶液，用甲醇逐級稀釋，以信噪比(S/N)為3∶1時對應的溶液中目標物的質量濃度為方法檢出限，以10∶1時對應的溶液中目標物的質量濃度為定量限，結果見表2。
表2 質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量限
Tab. 2 Linear range of mass concentration，linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantification limit
2.3.3 精密度試驗
取平喘合劑(批號24022302)樣品6份，制備平喘合劑樣品溶液，按1.2色譜條件進行分析，記錄色譜峰面積并計算芍藥苷及黃芩苷的含量，結果見表3。由表3可見，測定結果的相對標準偏差（RSD）分別為2.07%和1.29%，說明該方法精密度良好，滿足測定要求。
表3 精密度試驗結果
Tab. 3 Results of precision test
2.3.4 穩(wěn)定性試驗
取平喘合劑(批號24022302)，制備平喘合劑樣品溶液，分別于第0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，記錄色譜峰峰面積并計算相對標準偏差，具體結果見表4。由表4可見，樣品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。
表4 穩(wěn)定性試驗結果 (n=6)
Tab. 4 Results of stability test (n=6)
2.3.5 樣品加標回收試驗
精密量取平喘合劑(批號24022302) 0.5 mL，共6份，分別置25 mL容量瓶中，各精密加入混合對照品溶液(其中芍藥苷質量濃度為3.11 μg/mL，黃芩苷質量濃度為16.0 μg/mL) 15 mL，再加入70%乙醇定容至標線，搖勻，濾過，取續(xù)濾液1 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加70%乙醇至標線，搖勻，取續(xù)濾液。依法測定并計算回收率，結果見表5。結果表明，該方法回收率良好，滿足分析要求。
表5 樣品加標回收試驗結果
Tab. 5 Results of recovery test
3、 結語
建立了HPLC法同時測定平喘合劑中芍藥苷和黃芩苷含量測定的方法，該方法具有較高的準確度和較好的精密度，簡便易行，可用于平喘合劑的質量控制，為該制劑臨床用藥安全、有效提供了試驗數據。
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引用本文： 聶金娥，曲遠均，錢芳芳，等 . 高效液相色譜法測定平喘合劑中芍藥苷和黃芩苷［J］. 化學分析計量，2024，33（10）：11. (NIE Jin'e, QU Yuanjun, QIAN Fangfang, et al. Determination of paeoniflorin and baicalin in Pingchuan Heji by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(10): 11.)
來源：Internet
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