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前置知識

 

ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶聯(lián)免疫吸附試驗）是一種常用的實驗技術(shù)，用于檢測和定量分析樣品中特定抗原或抗體的存在。ELISA是基于免疫學(xué)原理的一種高靈敏度和高特異性的實驗方法。

 

ELISA實驗通常包括以下步驟：

 

1. 涂覆：將待檢測的抗原或抗體溶液加入到微孔板（通常是96孔板）中，并在孔板表面上形成一層固定的抗原或抗體。這個過程被稱為涂覆。

 

2. 阻斷：為了防止非特異性結(jié)合，需要在涂覆后加入一種阻斷劑，例如牛血清蛋白（BSA）或牛奶粉，以覆蓋孔板上未被固定的表面。阻斷劑可以減少非特異性結(jié)合和降低背景信號。

 

3. 樣品加入：將待測樣品加入到微孔板中，樣品中的目標(biāo)抗原或抗體與固定在孔板上的抗體或抗原相互作用。

 

4. 洗滌：通過反復(fù)洗滌孔板，去除未結(jié)合的物質(zhì)，以減少背景信號。

 

5. 探針加入：加入與待測物體特異性結(jié)合的酶標(biāo)記二抗（例如辣根過氧化物酶-HRP）或酶標(biāo)記抗原，使其與樣品中的目標(biāo)物體結(jié)合。

 

6. 洗滌：再次洗滌孔板，去除未結(jié)合的酶標(biāo)記物。

 

7. 底物加入：加入一種底物，其與酶標(biāo)記物相互作用，產(chǎn)生可測量的信號。常用的底物是一種可被酶催化產(chǎn)生顏色或熒光的物質(zhì)。

 

8. 反應(yīng)停止：通過加入一種停止劑，停止底物的反應(yīng)，阻止信號進(jìn)一步增加。

 

9. 信號測量：使用光譜儀或熒光測量儀測量底物反應(yīng)產(chǎn)生的信號，根據(jù)信號的強度來確定樣品中目標(biāo)物體的濃度。

 

ELISA是分子生物學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究中常用到的實驗操作之一，相信大家常常會有這樣那樣的實驗問題。

 

問題：ELISA空白背景高的常見原因和處理方法

 

通常陰性孔吸光光度值不會超過0.1。

 

常見原因有以下這些：

 

1）洗板不干凈

 

解決方法：

 

①充分洗滌：如果洗板的時間不夠，會導(dǎo)致抗體殘留，陰性對照會顯色，嘗試延長洗板時間，增加洗板頻率，在洗液中添加表面活性劑Tween-20。

 

在洗板時要保證每步都洗滌完全，充分拍板直至孔內(nèi)沒有明顯的殘留液體。

 

②避免交叉污染：棄去洗液和孵育的抗體時避免交叉污染，移液槍頭盡可能一次性使用，拍板的濾紙不要反復(fù)使用。

 

2）顯色液變質(zhì)或者試劑過期

 

解決方法：檢查試劑盒有效期，或使用新的試劑盒并按照說明書要求保存試劑盒。每次用剩下的顯色液最好不要回收，或者只回收洗凈的容器裝的顯色液。

 

3）試劑稀釋有誤，檢測抗體/酶結(jié)合物工作液濃度過高

 

解決方法：按照說明書推薦的稀釋倍數(shù)稀釋抗體。

 

4）試劑盒組分未平衡

 

解決方法：試劑盒每個組分都需要平衡至室溫后進(jìn)行實驗。

 

5）混用其他試劑盒試劑

 

解決方法：保證使用試劑盒內(nèi)完整的一套試劑進(jìn)行實驗，不同品牌及不同批次間的試劑可能存在不匹配現(xiàn)象，不同批號的試劑不要混用。

 

6）蒸餾水受酶等污染

 

解決方法：使用新鮮蒸餾水。

 

7）培養(yǎng)箱溫度超過37℃或反應(yīng)時間過長

 

解決方法：孵育時間過長、溫度過高可能會導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加，從而造成本底增高。檢查恒溫箱，確保孵育溫度穩(wěn)定在37℃，按照說明書的反應(yīng)時間進(jìn)行孵育。

 

8）酶標(biāo)板底部有污漬

 

解決方法：在加完終止液之后，檢測之前，用75%乙醇浸潤的脫脂棉球擦拭酶標(biāo)板底部，確認(rèn)沒有污漬之后再檢測。

 

9）洗液被污染

 

解決方法：洗液現(xiàn)配現(xiàn)用，長期放置會析出，也可能會污染，導(dǎo)致背景偏高。

 

10）包被的抗原被污染

 

解決辦法：仔細(xì)回想操作過程，換新的抗原包被。

 

11）封閉液、封閉時間、封閉液的濃度

 

解決辦法：封閉液（BSA）可能會與抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。封閉液的濃度偏低、封閉時間過短導(dǎo)致封閉不徹底，抗體與酶標(biāo)板結(jié)合，可能也會導(dǎo)致背景偏高，因此可以適當(dāng)調(diào)整封閉液的濃度和時間以降低背景。

 

12）抗體質(zhì)量差或選擇的抗體不合適

 

解決辦法：抗體質(zhì)量不高，特異性不好可能會與封閉液（BSA）產(chǎn)生交叉反應(yīng)，可以用0.8%明膠（明膠不含有血清成分）代替。

 

若選擇多克隆抗體孵育，可能會與酶標(biāo)單抗產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致背景增加，最好選用與酶標(biāo)單抗同種屬的多克隆抗體。

 

13）酶標(biāo)儀設(shè)置參數(shù)有誤

 

解決辦法：檢查酶標(biāo)儀設(shè)置的波長，不同波長下樣品的吸光光度值也會有很大的差別，按照說明書要求設(shè)置參數(shù)。

 

參考資料：

 

https://www.wellplate.com/immunoassay-surfaces/

 

https://www.news-medical.net/life-sciences/Enzyme-linked-Immunosorbent-Assay-%28ELISA%29-Methodology.aspx