中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

同源重組法質(zhì)粒構(gòu)建在基因功能研究、蛋白表達(dá)和純化的等方面具有廣泛的應(yīng)用。內(nèi)容包括了基因的敲除、敲低以及過表達(dá)等等，用于研究基因的功能、表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及對細(xì)胞生理過程和表型的影響。另外通過優(yōu)化啟動子、核糖體結(jié)合位點等表達(dá)元件，以及選擇合適的宿主細(xì)胞，利用同源重組法構(gòu)建表達(dá)載體，使目的蛋白在宿主細(xì)胞中大量表達(dá)，從而達(dá)到目的蛋白表達(dá)和純化的目的。

 

 

 

通過同源重組構(gòu)建重組 MVA 載體

 

相較于傳統(tǒng)酶切傳統(tǒng)酶切法依賴于限制性內(nèi)切酶對DNA的特異性切割而言，同源重組法質(zhì)粒構(gòu)建基于DNA分子間的同源序列進(jìn)行重組。因此這里主要介紹同源重組法質(zhì)粒構(gòu)建的實驗步驟和注意事項等。

 

一、流程圖

 

 

二、實驗步驟

 

1.獲取插入目的片段：

 

（1）引物設(shè)計：在插入片段正反向擴(kuò)增引物的5’端引入線性化載體兩末端同源序列，使擴(kuò)增后的插入片段5'和3'最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應(yīng)一致的同源序列，長度一般為15-20bp，不包括酶切位點。

 

引物設(shè)計原則：同源臂+酶切位點+特異性引物（目的片段的一段序列），計算退火溫度時只計算基因特異性擴(kuò)增序列的Tm值，引入的同源序列和酶切位點不參與計算。

 

此時可以借助SnapGene軟件進(jìn)行協(xié)助，從NCBI獲取到自己基因的目的片段序列導(dǎo)入SnapGene，在添加同源臂和酶切位點會更加直觀，同時可以看見引物對的Tm值。

 

（2）PCR擴(kuò)增：使用高保真聚合酶擴(kuò)增插入片段，無需考慮產(chǎn)物末端有無A尾。為確保最優(yōu)條件，可先設(shè)置梯度PCR確定最佳退火溫度，再根據(jù)高保真聚合酶的特性配置PCR體系，并依據(jù)擴(kuò)增片段的大小設(shè)置合適的延伸時間，確定最佳的PCR條件。

 

2.獲取線性載體：

 

（1）選擇克隆位點：挑選合適的克隆位點對載體進(jìn)行線性化，優(yōu)先選擇無重復(fù)序列且載體克隆位點上下游20bp區(qū)域內(nèi)GC含量在40%-60%之間的位點。

 

（2）選擇線性化方式：可采用限制性內(nèi)切酶消化或反向PCR擴(kuò)增。使用限制性內(nèi)切酶消化時，推薦雙酶切方法使載體線性化完全，可以保證載體線性化完全；若使用單酶切線性化，則需適當(dāng)延長酶切時間以減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。而采用反向PCR擴(kuò)增制備線性化載體時，要使用高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，減少擴(kuò)增突變的引入。

 

3.膠回收純化：

 

根據(jù)載體和插入片段的大小確定相應(yīng)濃度的膠進(jìn)行膠回收。膠回收完成后瓊脂糖凝膠電泳驗證回收產(chǎn)物，用分光光度計（如 Nanodrop）檢測插入片段和線性化載體的濃度以定量。

 

4.重組反應(yīng)：

 

（1）稀釋：計算重組反應(yīng)所需的線性化載體和插入片段所需DNA量，并進(jìn)行稀釋擴(kuò)大吸取量，確保各組分加入量不低于1ul。

 

（2）配置反應(yīng)體系：冰上配置反應(yīng)體系，用移液器輕輕吸打混勻，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底，另外酶置于冰上保存并最后加入。

 

（3）反應(yīng)：將反應(yīng)體系置于PCR儀器中，37℃反應(yīng)30min，然后降至4℃或立即置于冰上冷卻。重組產(chǎn)物可于-20℃存放一周，待需要時解凍轉(zhuǎn)化。

 

5.重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化：

 

（1）解凍感受態(tài)細(xì)胞：冰上解凍感受態(tài)細(xì)胞，如常用DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

 

（2）加入重組產(chǎn)物：取適量重組產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上靜置30min。需注意重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化體積最多不應(yīng)超過所用感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10。

 

（3）熱激與復(fù)蘇：42℃水浴熱激45s后，立即置于冰上冷卻3min，再加入新鮮LB培養(yǎng)基，37℃，200rpm搖菌復(fù)蘇1h。

 

（4）涂板培養(yǎng)：將菌液離心，棄掉部分上清，用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12~16h。

 

6.重組反應(yīng)產(chǎn)物鑒定：

 

（1）菌落PCR鑒定：挑取LB板上的單克隆若干個進(jìn)行菌落PCR鑒定，擴(kuò)增引物盡量選擇載體部分序列上的引物，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和使用的酶確定延伸時間和PCR程序，瓊脂糖凝膠電泳檢測克隆正確時應(yīng)有長度略大于插入片段大小的條帶出現(xiàn)。

 

（2）測序鑒定：對菌落PCR鑒定為陽性的菌落，可進(jìn)一步接種培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定或者直接測序鑒定，以確保重組質(zhì)粒的準(zhǔn)確性。

 

三、注意事項

 

（1）引物設(shè)計：同源臂的長度一般為15-20bp，且GC含量應(yīng)在40%-60%之間；計算引物Tm值時，僅考慮特異性引物部分，不包括同源臂和酶切位點。若引物長度超過40bp，在引物合成時可選用PAGE純化方式，以提高陽性克隆率。

 

（2）模板選擇：進(jìn)行PCR擴(kuò)增插入片段時，若目的片段較難擴(kuò)增，可先使用不帶同源臂的引物克隆目的片段，再以膠回收產(chǎn)物為模板，用帶有同源臂的引物進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增，但要注意此方法可能會引入較多突變。

 

（3）酶切與線性化：使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行載體線性化時，要確保酶切完全，可通過延長酶切時間或采用雙酶切方法來實現(xiàn)。若使用單酶切線性化載體，需注意原生環(huán)狀質(zhì)粒殘留可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化不準(zhǔn)確 。

 

（4）片段純化：膠回收過程中要使用新的刀片，防止外源DNA污染。同時，要確保膠回收產(chǎn)物的質(zhì)量和濃度，以便后續(xù)準(zhǔn)確計算使用量。

 

（5）比例與用量：嚴(yán)格按照載體與插入片段的最適摩爾比1:2來計算和使用兩者的量，以提高重組效率。若使用未經(jīng)純化的線性化克隆載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物，其加入總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5。

 

（6）重組反應(yīng)條件：重組反應(yīng)需在冰上配置反應(yīng)體系，移液器輕輕吸打混勻，避免振蕩。反應(yīng)溫度和時間要嚴(yán)格控制，一般為37℃反應(yīng)30min左右，反應(yīng)時間不足或過長都可能降低克隆效率。

 

（7）轉(zhuǎn)化過程：感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)在冰上解凍，加入重組產(chǎn)物后要輕輕混勻，避免損傷細(xì)胞。熱激時間和溫度要準(zhǔn)確把握，熱激后需迅速置于冰上冷卻。此外，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的涂布量也要適中，過多或過少都可能影響陽性克隆的篩選，此時，可以設(shè)置涂布的量和濃度。

 

（8）鑒定環(huán)節(jié)：菌落PCR鑒定時，要選擇合適的引物和PCR程序，確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。對于初步鑒定為陽性的菌落，最好進(jìn)行測序鑒定，以最終確定重組質(zhì)粒的正確性。