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目前常用的細胞毒性測定方法有MTT法和CCK-8法，相較于MTT法，cck-8法具有無毒性、效率高等優(yōu)點而被廣為使用。今天介紹一下cck-8法的實驗步驟及操作技巧。

 

CCK-8法的原理

 

CCK-8全稱Cell Counting Kit-8，是一種基于WST-8的應用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度檢測試劑盒。其工作原理為在電子耦合試劑存在的情況下，WST-8這一物質可以被線粒體脫氫酶還原成橙黃色的甲臜產(chǎn)物，且其顏色深淺與細胞增殖程度成正比，與細胞毒性程度成反比。

 

實驗步驟

 

1）制備細胞懸液：若為懸浮細胞則直接離心收集對數(shù)生長期的細胞；若為貼壁細胞則用胰酶消化后離心收集細胞。將收集到的細胞用含血清培養(yǎng)基重懸后，用血細胞計數(shù)板計數(shù)，再稀釋為5×10^3~5×10^4個/ml的單細胞懸液。

 

2）在96孔板中接種細胞懸液，每孔100μl，同時設計不同的濃度組，每個濃度組可設計3~6個復孔，且設置好空白組和對照組。

 

3）將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24h左右（37℃, 5%CO2）。

 

4）向培養(yǎng)板各孔中加入不同濃度的待測物質（藥物、化學試劑等）放入培養(yǎng)箱中孵育6~96h。

 

6）向每孔中加入10μl CCK-8溶液，加完試劑后輕輕晃動培養(yǎng)板以幫助混勻（防止因CCK8試劑沾在孔壁上而帶來的誤差），加樣的過程中盡量不要產(chǎn)生氣泡，以免影響OD值讀數(shù)。

 

7）將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育1-4h。

 

8）用酶標儀測定450nm處的吸光度（OD）。

 

 

注意事項

 

（1）接種細胞數(shù)：針對標準96孔板，貼壁細胞的最小接種量為1000個/孔 (100μl培養(yǎng)基)。若為白細胞，接種量不低于2500個/孔 (100μl培養(yǎng)基)。若使用24孔板或6孔板，應預先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

 

（2）在細胞毒性實驗中，還應考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測定450nm的吸光度作為空白對照。

 

（3）在培養(yǎng)箱中孵育期間，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，造成體積不準確，從而增加誤差，因此，建議最外一圈的孔只加PBS，不作為測定孔用。

 

（4）加入待測物之后培養(yǎng)的具體時間6~96h要看待測物質的性質和細胞的敏感性，例如6、12、24、48h。實驗時可以選擇不同作用時間下進行細胞毒性檢測。

 

（5）如果待檢測物質有氧化性或還原性，在加入CCK-8之前要更換新鮮培養(yǎng)基，以去掉待測物質的影響。如果影響比較小或者沒有影響，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

 

（6）正常顯色時間為1-4h，可以每半小時測定一次OD值，使其OD值保持在1-2之間后固定顯色時間重復實驗。

 

（7）因為細胞種類不同，形成的formazan的量也不一樣，所以如果顯色不夠的話，可以延長培養(yǎng)時間，特別是血液細胞需要較長的顯色時間（5-6h）。

 

（8）測定波長：如果樣品為高渾濁度的細胞懸液，建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm，建議選650nm。

 

（9）若暫時不測定OD值，可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，室溫避光保存， 24h內測定OD值不會發(fā)生變化。

 

（10）新鮮的CCK-8試劑為粉紅色，儲存時間過長則顏色加深、效率變低，最好不使用。通常情況下CCK-8試劑在0-5℃避光條件下可保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。

 

常見問題

 

為什么復孔之間的重復性不好？

 

（1）可能在接種細胞時不小心帶入了氣泡。為避免這種情況，應及時更換槍頭，且沿著側壁將細胞懸液加入96孔板中，避免槍尖在打液的過程中插入液面下方從而產(chǎn)生氣泡。若已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，可用1ml注射器針頭燒熱后將氣泡戳破減小誤差。

 

（2）可能是在換液過程中將貼壁的細胞滑散了。為避免這種情況請在細胞貼壁后注意沿側壁底面利用槍頭的虹吸作用將孔內的培養(yǎng)基吸取出來。

 

（3）可能是在換液過程種沒有將孔內的液體洗凈就加入了新的培養(yǎng)基。

 

（4）可能是加入的CCK-8試劑微量沒有加準。為避免這種情況，可以直接配制含10% CCK-8的培養(yǎng)基，以換液的形式加入96孔板中，每孔100μl。

 

計算方法

 

細胞抑制率 =（對照-實驗）/（對照-空白）×100%

 

對照：具有細胞、培養(yǎng)基、CCK-8的孔的OD值

 

實驗：具有細胞、培養(yǎng)基、CCK-8和藥物溶液的孔的OD值

 

空白：具有培養(yǎng)基和CCK-8的孔的OD值