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質(zhì)粒載體是分子生物學(xué)研究中使用十分普遍的工具之一，含有我們目的片段的質(zhì)粒常常通過(guò)轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于體外探究外源基因的生物學(xué)功能。通過(guò)對(duì)基因進(jìn)行修飾例如點(diǎn)突變、過(guò)表達(dá)、敲低、敲除等手段獲得不同質(zhì)粒，這為一些分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)例如功能增益缺失實(shí)驗(yàn)、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)都提供了便利的基礎(chǔ)。

 

質(zhì)粒構(gòu)建，我們首先需要獲取我們需要構(gòu)建在原生質(zhì)粒載體上的目的片段，如過(guò)表達(dá)載體一般會(huì)構(gòu)建目的基因的cds區(qū)，雙熒光素酶報(bào)告基因載體一般是構(gòu)建包含結(jié)合位點(diǎn)的目的片段，其次我們可以根據(jù)選定的目的片段通過(guò)Snapgene軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。獲取目的的片段后，我們需要對(duì)獲取的目的片段和選取的質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切暴露出粘性末端；然后用T4連接酶進(jìn)行酶連。連接產(chǎn)物通過(guò)感受態(tài)細(xì)胞（DH5α）轉(zhuǎn)化，最后進(jìn)一步對(duì)單克隆菌落進(jìn)行鑒定。

 

在這里主要介紹傳統(tǒng)雙酶切的質(zhì)粒構(gòu)建方法：

 

1、目的片段的獲?。夯蚪MDNA、cDNA

 

 

注意：上述過(guò)程中前三個(gè)步驟均可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳通過(guò)DNA marker初步確認(rèn)所獲取的片段并進(jìn)行瓊脂糖凝膠純化回收（試劑盒），測(cè)定濃度。

 

過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建的步驟：以人p65基因?yàn)槔?，質(zhì)粒載體為PcDNA3.1(+)

 

（1）目的片段的獲取、擴(kuò)增

 

①通過(guò)NCBI網(wǎng)站獲取p65基因的cds區(qū)：1647bp

 

圖1

 

圖2

 

②點(diǎn)擊CDS:

 

圖3 CDS區(qū)

 

③復(fù)制標(biāo)紅區(qū)域進(jìn)入Snapgene軟件，新建DNA文件：

 

圖4

 

④點(diǎn)擊序列（sequence）：然后編輯——插入——限制性酶切位點(diǎn)（選擇NotI、XhoI）

圖5

 

⑤其次對(duì)目的片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)原則：正向引物 （F）：選擇的限制性內(nèi)切酶的常用保護(hù)堿基+酶切位點(diǎn)+目的片段前18-22bp；反向引物（R）：選擇的限制性內(nèi)切酶的常用保護(hù)堿基+酶切位點(diǎn)+目的片段后 18-22bp的反向互補(bǔ)序列。

 

Forward：

 

圖6

 

Reserve:

 

圖7

 

⑥此時(shí)我們打開(kāi)snapgene軟件的引物框，對(duì)引物進(jìn)行優(yōu)化；優(yōu)化原則包括Tm值、GC含量、引物長(zhǎng)度等。

 

圖8

 

圖9

 

（2）獲取引物后對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得我們需要的目的片段（表 1），并通過(guò)瓊脂凝膠電泳鑒定：snapgene模擬瓊脂糖凝膠電泳（圖10）。

表1 PCR擴(kuò)增體系

 

圖10

 

2、酶切質(zhì)粒載體和目的片段 

 

選擇NotI、XhoI雙酶切質(zhì)粒載體PcDNA3.1(+)和目的片段，并用瓊脂糖凝膠電泳鑒定 。

 

表2 酶切體系

圖11 PcDNA3.1(+)質(zhì)粒

 

3、酶連

 

通過(guò)T4連接酶過(guò)夜連接。

 

 

 

注意：酶切質(zhì)粒與酶切目的片段的比值一般為1:3或者1:4。

 

4、使用DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化

 

①取4ul或者5ul連接產(chǎn)物，加入到50ul或者100ulDH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，靜置冰浴30min；②打開(kāi)水浴鍋至42℃，熱激45s；③冰浴2min;⑤于超凈工作臺(tái)加入適量LB液體培養(yǎng)基，混勻；⑥37℃，200rpm搖床約1h；⑦涂含相應(yīng)抗生素的LB平板。

 

5、最終對(duì)平板的單克隆菌落進(jìn)行篩選鑒定（菌落PCR/DNA測(cè)序）

 

表3 菌落PCR的體系

 

對(duì)第二天長(zhǎng)出來(lái)的單克隆菌落進(jìn)行初步菌落PCR；根據(jù)表3的PCR擴(kuò)增體系基本步驟如下：①對(duì)選取的單克隆菌落做好標(biāo)記（序號(hào)、日期），以便于后續(xù)搖菌提取質(zhì)粒；②加入10ul無(wú)核酶水透明的八聯(lián)管或者200ul的PCR管（標(biāo)記相對(duì)應(yīng)的序號(hào)），用10ul的移液槍用tip頭沾取菌落于PCR管中吹打；③用封口膜封好LB平板；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上按照表3的體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增；④最后用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證DNA條帶有無(wú)或者位置是否正確 。

 

6、驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

 

后續(xù)若進(jìn)行功能性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)還需要進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率并通過(guò)RT-qPCR、蛋白免疫印記技術(shù)對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

 

7、注意事項(xiàng)

 

提及一下雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建，常用的質(zhì)粒載體有pmirGLO Vector(7350bp)、Psicheck-2（ 6273bp），通常應(yīng)用于啟動(dòng)子相關(guān)的、miRNA-mRNA、lncRNA-miRNA的靶向驗(yàn)證關(guān)系。以miRNA-mRNA為例，通過(guò)TargetScan 在線靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)所研究miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)，尋找靶基因于miRNA的結(jié)合序列前后200-300構(gòu)建值雙熒光素酶報(bào)告基因載體中，并突變掉結(jié)合位點(diǎn)的幾個(gè)堿基，同樣構(gòu)建200-300bp左右至雙熒光素酶報(bào)告基因載體中。最后結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告基因的原理進(jìn)行靶向驗(yàn)證。