中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

一、細(xì)胞周期

 

細(xì)胞周期反映了細(xì)胞增殖速度。在這個(gè)過程中，細(xì)胞的DNA復(fù)制并加倍，在分裂結(jié)束時(shí)平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去。在細(xì)胞周期的不同時(shí)相，包括G1/G0期(2C DNA)、S期(介于2C~4C之間)和G2/M(4C DNA)，DNA含量存在差異，用DNA染料(PI是最經(jīng)典的)進(jìn)行染色，染料的熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比，從熒光強(qiáng)度的變化，可以判斷細(xì)胞所處的細(xì)胞周期時(shí)相。結(jié)合每個(gè)周期時(shí)相的細(xì)胞數(shù)目，可以判斷各時(shí)相細(xì)胞所占百分比，從而判斷細(xì)胞周期狀況。

 

 

 

1.材料 

 

腫瘤細(xì)胞系、15ml 管、EP管、吸頭、移液器和400目濾網(wǎng)試劑乙醇、胰酶、1XPBS、細(xì)胞周期試劑盒。

 

2.實(shí)驗(yàn)步驟

 

①制備單細(xì)胞懸液：

 

1）使用長滿細(xì)胞的10厘米培養(yǎng)皿。

 

2）收集上清至15毫升離心管中。

 

3）用1XPBS洗滌一次，再次收集至15毫升離心管中。

 

4）加入1毫升胰酶，靜置4分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況。當(dāng)細(xì)胞形態(tài)變?yōu)閳A形時(shí)，加入胰酶至15毫升離心管中。 

 

5）輕輕拍打皿底，幫助細(xì)胞從表面脫落，形成單細(xì)胞懸液。

 

6）加入1XPBS將細(xì)胞收集至15毫升離心管中。

 

7）以1500 rpm離心5分鐘，棄去上清液。

 

②周期染色：

 

1）加入500μL 1XPBS液，使1x106細(xì)胞懸浮于15ml離心管中。

 

2）緩慢加入冰冷的無水乙醇至2ml，最終濃度達(dá)到75%，并在4°C保存過夜。

 

3）以1500 rpm離心5分鐘，棄去上清液。

 

4）加入1ml 1XPBS，懸浮細(xì)胞，再次離心洗滌1遍。

 

5）棄去上清液，加入300μL  PI/RNase染色液，混勻后在避光條件下室溫染色15分鐘。使用400目篩網(wǎng)過濾單細(xì)胞懸液。

 

6）上機(jī)檢測

 

7）Modifit軟件模擬檢測結(jié)果

 

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果解讀

 

 

上圖是筆者自己做的流式周期實(shí)驗(yàn)

 

X軸（FL2-A PE-A）表示熒光強(qiáng)度，反映DNA含量。Y軸（Number）表示細(xì)胞數(shù)量。

 

G1峰（深紅色區(qū)域）：左側(cè)的高峰，表示處于G1期的細(xì)胞，占總細(xì)胞的65.71%，對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度為32.42。這是因?yàn)镚0/G1期的細(xì)胞DNA含量較少（相對(duì)于G2/M期），因此熒光強(qiáng)度較低。 

 

G2峰：右側(cè)的次高峰，表示處于G2期的細(xì)胞，占總細(xì)胞的4.96%，對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度為62.51。G2/M期的細(xì)胞熒光強(qiáng)度最高，因?yàn)槠銬NA含量是G1期的兩倍。

 

S期區(qū)域（斜紋藍(lán)色區(qū)域）：G1和G2峰之間的區(qū)域，表示正在進(jìn)行DNA復(fù)制的細(xì)胞，占總細(xì)胞的29.33%。

 

二、細(xì)胞凋亡

 

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，其外翻是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)，使得細(xì)胞表面發(fā)生分子組成的變化，從而被免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除。AnnexinV是一種分子量為 35~36kD 的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能夠高親和力地結(jié)合到PS上，其結(jié)合不依賴于細(xì)胞是否處于凋亡狀態(tài)，因此它能夠標(biāo)記所有PS外翻的細(xì)胞，包括早期凋亡細(xì)胞。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一種熒光核酸染料，能夠結(jié)合到DNA和RNA上。由于其分子較大，無法穿透活細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，因此只能進(jìn)入膜完整性受損的細(xì)胞，如凋亡中晚期和壞死細(xì)胞。

 

通過使用熒光標(biāo)記的Annexin V（如Annexin V-FITC）與PI的聯(lián)合染色，可以在流式細(xì)胞儀上同時(shí)檢測PS的外翻和細(xì)胞膜的完整性，從而區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、中晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。

 

 

1.材料 

 

腫瘤細(xì)胞系、FALCON 管、EP管、吸頭、移液器和400目濾網(wǎng)，胰酶、1XPBS、凋亡試劑盒

 

2.實(shí)驗(yàn)步驟

 

①具體分組：

 

對(duì)照組（未經(jīng)過任何處理的正常細(xì)胞，作為實(shí)驗(yàn)的基線數(shù)據(jù)）

 

實(shí)驗(yàn)組（根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可能會(huì)有多個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)組都經(jīng)過特定的處理，如藥物處理、輻射、基因敲除等）

 

單染組（分別使用Annexin V和PI單獨(dú)染色，用于流式細(xì)胞儀的補(bǔ)償調(diào)節(jié)和確定染色的特異性）

 

未染色組（未進(jìn)行任何染色的細(xì)胞，用于確定細(xì)胞的自發(fā)熒光水平）

 

②制備單細(xì)胞懸液：

 

與上述細(xì)胞周期收集單細(xì)胞懸液操作相同。

 

③凋亡檢測的染色(FITC/PI雙染試劑盒)：

 

1）將細(xì)胞懸浮于500μL 1X Binding Buffer中，均勻分裝4到個(gè)離心管中（每管1 X 106細(xì)胞），包括未染色管、FITC單陽管、PI單陽管，F(xiàn)ITC_PI雙陽管。在管子上進(jìn)行標(biāo)記，并放置于冰盒中。

 

2）在FITC單陽管，F(xiàn)ITC_PI雙陽管中分別加入5μl Annexin V-FITC。

 

3）在PI單陽管，F(xiàn)ITC_PI雙陽管中分別加入5μl PI后輕輕混勻。

 

4）在室溫避光條件下孵育15分鐘。

 

5）將所有實(shí)驗(yàn)管中加入200μl 1X Binding Buffer。

 

6）使用400目篩網(wǎng)過濾單細(xì)胞懸液。

 

7）上機(jī)檢測。

 

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果解讀

 

 

Annexin V-FITC單陽性細(xì)胞（Q3）為早期凋亡細(xì)胞。Annexin V-FITC和PI染色雙陽性的細(xì)胞（Q2）為壞死細(xì)胞或者晚期凋亡。PI單染色陽性（Q1）為裸核細(xì)胞，即發(fā)生機(jī)械損傷的細(xì)胞。Annexin V-FITC和PI染色雙陰性的細(xì)胞（Q4）為正常細(xì)胞。