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一、siRNA設(shè)計(jì)

 

小干擾RNA（Small interfering RNA；siRNA）是一段長度在20-25個核苷酸之間的RNA雙鏈，其生物應(yīng)用較多，目前主要用于干擾RNA，達(dá)到調(diào)節(jié)基因表達(dá)（敲減）的目的，其本質(zhì)是siRNA和相應(yīng)的mRNA特異性結(jié)合、降解，繼而實(shí)現(xiàn)阻滯mRNA繼續(xù)翻譯的目的。

 

 

 

設(shè)計(jì)原則：

 

1.siRNA序列不宜過長，超過30nt易導(dǎo)致其與其他mRNA非特異性結(jié)合，一般以19-25nt之間為宜。

 

2.GC含量控制在35-55%之間，基因沉默效果最好。

 

3.siRNA序列設(shè)計(jì)的靶序列一般為目的基因的CDS序列。

 

4.一般siRNA需設(shè)計(jì)2-4條，另需要對照1-2條，序列設(shè)計(jì)完成后需要在BLAST中（BLAST: Basic Local Alignment Search Tool (nih.gov)進(jìn)行比對，選擇與靶基因特異性結(jié)合的序列進(jìn)行合成即可。

 

上述原則是在設(shè)計(jì)siRNA時可以選擇的一些參數(shù)，此外還有較為細(xì)節(jié)的原則如siRNA序列選擇的位置、開始的堿基及序列及避免堿基單一等原則在使用三方網(wǎng)站設(shè)計(jì)時一般會自動規(guī)避。

 

siRNA合成后，一般是粉末狀，根據(jù)說明書加入相應(yīng)稀釋液配置成相應(yīng)濃度，配置完成后建議使用最小體積的Ep管分裝（推薦5μl分裝一次）并于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融。

 

二、siRNA轉(zhuǎn)染

 

（1）Lipo8000™轉(zhuǎn)染

 

Lipo8000™試劑是一種簡便高效的轉(zhuǎn)染試劑，適用于質(zhì)粒、siRNA及其他DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染，同時，Lipo8000™試劑具有較小的細(xì)胞毒性，轉(zhuǎn)染后全程一般無需換液，24-48h后可直接收集細(xì)胞進(jìn)行WB或RT-PCR驗(yàn)證。

 

轉(zhuǎn)染步驟：

 

1.轉(zhuǎn)染前一天鋪細(xì)胞，保證第二天轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度可達(dá)70-80%。

 

2.轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipo8000™試劑、siRNA及其他常見處理細(xì)胞的試劑、耗材。

 

3.轉(zhuǎn)染復(fù)合物配置如下表，按體積依次加入相應(yīng)試劑并輕輕混勻，室溫孵育20mins。

 

 

4.復(fù)合物等待期間將培養(yǎng)基換成新鮮的完全培養(yǎng)基（六孔板-2mL）。

 

5.20分鐘后，將復(fù)合物加入到相應(yīng)孔中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱，禁止振蕩混勻。

 

注意事項(xiàng)：

 

1.由于Lipo8000™試劑毒性較小，轉(zhuǎn)染前換液可加含抗生素的完全培養(yǎng)基。

 

2.轉(zhuǎn)染siRNA后，驗(yàn)證時間至少要求轉(zhuǎn)染后48h，一般3-5天后驗(yàn)證時才會有較為明顯的蛋白表達(dá)或RNA水平下降。

 

（2）Lipofectamine ™ RNAiMAX轉(zhuǎn)染

 

Lipofectamine ™ RNAiMAX轉(zhuǎn)染主要供siRNA和Stealth ™ RNAi 雙鏈體轉(zhuǎn)染使用，具有轉(zhuǎn)染效率高、對細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。

 

轉(zhuǎn)染步驟：

 

1.轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備試劑包括：Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine™ RNAiMAX試劑、siRNA、不加雙抗的10%FBS培養(yǎng)基、胰酶、PBS緩沖液等常見處理細(xì)胞的試劑。

 

2.細(xì)胞密度≥90%。

 

3.按正常處理細(xì)胞的流程將長滿的細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化離心后去上清，注意此處需要加無雙抗的10%FBS培養(yǎng)基1ml進(jìn)行細(xì)胞重懸，重懸完后根據(jù)細(xì)胞生長速度鋪細(xì)胞，保證轉(zhuǎn)染完后24h細(xì)胞密度達(dá)到30-50%。

 

4.轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備：根據(jù)說明書制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，添加量如下表所示。根據(jù)轉(zhuǎn)染的實(shí)際用量將Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine™ RNAiMAX試劑、siRNA依次加入到一個無菌Ep管中，按照先加Opti-MEM培養(yǎng)基、再加siRNA最后加Lipofectamine™ RNAiMAX試劑的順序，輕輕混勻室溫孵育20mins。

 

 

5.20mins后依次將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)皿種，輕輕混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。

 

注意事項(xiàng)：

 

1.轉(zhuǎn)染后24h內(nèi)最好不要挪動細(xì)胞，也不要拿出在顯微鏡下觀察，期間也無需進(jìn)行細(xì)胞換液。其表型可能在48-72h后逐漸顯現(xiàn)，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行細(xì)胞換液或收細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。

 

2.此種轉(zhuǎn)染方式最長可維持5-7天的基因敲除效果。

 

3. Lipofectamine™ RNAiMAX試劑在冰箱4℃保存，切記不可冷凍。