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[摘要] 作為一種新興的治療方法，寡核苷酸藥物（ONTs）在罕見病和某些慢性疾病領(lǐng)域展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景和開發(fā)潛力。目前，全球范圍內(nèi)已有20種ONTs上市，主要包括反義寡核苷酸（ASO）、小干擾RNA（siRNA）和適配體（Aptamer）等，并有越來(lái)越多的ONTs進(jìn)入臨床開發(fā)階段。業(yè)界已對(duì)ONTs的序列設(shè)計(jì)、化學(xué)修飾和遞送系統(tǒng)等積累了較多的經(jīng)驗(yàn)，但對(duì)于非臨床安全性評(píng)價(jià)尚缺乏系統(tǒng)認(rèn)識(shí)，也尚未形成全球監(jiān)管的一致要求。本文系統(tǒng)調(diào)研了ONTs的主要毒性來(lái)源及其影響因素，以及美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已批準(zhǔn)上市的ASO和siRNA藥物研究案例，在此基礎(chǔ)上闡述了ONTs非臨床安全性評(píng)價(jià)的研究?jī)?nèi)容、關(guān)注要點(diǎn)的一般考慮，以期為我國(guó)ONTs的研發(fā)提供參考。

[關(guān)鍵詞] 寡核苷酸藥物；非臨床；安全性評(píng)價(jià)；一般考慮

 

 寡核苷酸藥物（oligonucleotide therapeutics，ONTs）通常由20~60個(gè)核苷酸組成，主要包括反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和適配體（Aptamer）等[1]。作為一種新興的治療手段，ONTs不僅在罕見病領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，在其他慢性疾病治療領(lǐng)域（如高血壓和高血脂等）也顯示出巨大的開發(fā)潛力[2,3]。截至2024年1月，全球范圍內(nèi)已有20種ONTs獲批上市，并有越來(lái)越多的ONTs進(jìn)入臨床開發(fā)階段[4]。近年來(lái)，ONTs在合成工藝方面取得的重大突破也為新的ONTs的研發(fā)創(chuàng)造了契機(jī)。業(yè)界已對(duì)ONTs的序列設(shè)計(jì)、化學(xué)修飾和遞送系統(tǒng)等積累了較多的經(jīng)驗(yàn)，但對(duì)于非臨床安全性評(píng)價(jià)尚缺乏系統(tǒng)認(rèn)識(shí)，包括研究策略、研究?jī)?nèi)容和關(guān)注點(diǎn)等。

目前，國(guó)際上尚未形成統(tǒng)一的用于指導(dǎo)ONTs研發(fā)和評(píng)價(jià)的指導(dǎo)原則。僅日本藥品和醫(yī)療器械管理局（PMDA）于2020年3月發(fā)布了《ONTs的臨床前安全性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則》[5]（下文稱日本指導(dǎo)原則）。2024年11月，美國(guó)FDA發(fā)布了《Nonclinical Safety Assessment of Oligonucleotide-Based Therapeutics》草案，目前正在征求意見。國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, ICH）也啟動(dòng)了與該主題相關(guān)指導(dǎo)原則的起草工作。我國(guó)尚未發(fā)布相關(guān)指導(dǎo)原則。本文系統(tǒng)調(diào)研了ONTs的主要毒性來(lái)源及其影響因素，以及美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已批準(zhǔn)的ASO和siRNA藥物的研究案例，并對(duì)ONTs非臨床安全性評(píng)價(jià)的策略、研究?jī)?nèi)容和關(guān)注點(diǎn)進(jìn)行了概述，以期為我國(guó)ONTs的研發(fā)提供參考。

 

1.ONTs主要毒性來(lái)源和影響因素

ONTs的主要毒性分為兩類，即基于Watson-Crick互補(bǔ)配對(duì)原則的雜交依賴型毒性和基于化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和遞送載體的雜交非依賴型毒性[6]。雜交依賴型毒性又分為在靶毒性和脫靶毒性，前者由ONTs藥理學(xué)作用的放大引起，后者由ONTs與靶mRNA序列相似的轉(zhuǎn)錄本雜交而產(chǎn)生[7]。雜交非依賴型毒性不依賴于雜交，主要包括補(bǔ)體激活、血小板減少、凝血抑制、免疫刺激和高暴露器官的毒性反應(yīng)[6,8,9]。

未經(jīng)化學(xué)修飾的寡核苷酸易被廣泛存在于細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的核酸酶降解，與血漿蛋白結(jié)合的能力較弱，經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)后可被迅速清除，導(dǎo)致其在血漿中的半衰期較短，不利于靶組織分布和藥效發(fā)揮[10,11]。研究表明，化學(xué)修飾如硫代磷酸酯（PS）、2'-O-甲氧基乙基（MOE）可提高寡核苷酸對(duì)核酸酶的抗性，增強(qiáng)與血漿蛋白的結(jié)合，延長(zhǎng)在血漿中的半衰期[12]。因此，與未經(jīng)修飾的寡核苷酸相比，修飾后的寡核苷酸具有更好的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布特征，但也可能帶來(lái)新的毒性。

此外，給藥途徑和遞送載體也是影響ONTs毒性的重要因素。經(jīng)脂質(zhì)納米顆粒（Lipid Nanoparticle，LNP）遞送或N-乙酰氨基半乳糖（N-acetylgalactosamine, GalNAc）偶聯(lián)的siRNA能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)肝臟等臟器的高效遞送，同時(shí)由于在這些組織中的暴露量較高、半衰期相對(duì)較長(zhǎng)，導(dǎo)致聚集并引起相關(guān)毒性反應(yīng)[13]。

 

2. 已上市ONTs安全性特征

2.1已上市ONTs基本信息概述

截至2024年1月，全球范圍內(nèi)已經(jīng)批準(zhǔn)了20種ONTs上市（表1），其中ASO和siRNA占大多數(shù)，主要通過(guò)反義機(jī)制和適配體機(jī)制發(fā)揮藥理作用。

表1 已批準(zhǔn)上市的ONTs基本信息匯總

通用名	商品名	上市時(shí)間	藥物類型	靶點(diǎn)	臨床適應(yīng)癥	給藥途徑
Fomivirsen	Vitravene	1998	ASO	CMV	巨細(xì)胞病毒視網(wǎng)膜炎	ivt
Pegaptanib	Macugen	2004	Aptamer	VEGF	黃斑變性	ivt
Mipomersen	Kynamro	2013	ASO	ApoB	IIa型高脂蛋白血癥	sc
Eteplirsen	ExONTys 51	2016	ASO	Exon51	杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥	iv
Nusinersen	Spinraza	2016	ASO	SMN2	脊髓性肌萎縮癥	itt
Defibrotide	Defitelio	2016	Oligonucleotide	PAI-1+tPA+ vWF	肝靜脈閉塞性疾病	iv
Inotersen	Tegsedi	2018	ASO	TTR	遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性	sc
Patisiran	Onpattro	2018	siRNA	TTR	遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性	iv
Volanesorsena	Waylivra	2019	ASO	ApoC3	I型高脂蛋白血癥	sc
Golodirsen	VyONTys 53	2019	ASO	Exon53	杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥	iv
Givosiran	Givlaari	2019	siRNA	ALAS1	急性肝卟啉癥	sc
Viltolarsen	Viltepso	2020	ASO	Exon53	杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥	iv
Inclisiran	Leqvio	2020	siRNA	PCSK9	原發(fā)性高膽固醇血癥或混合性血脂異常	sc
Casimersen	AmONTys 45	2021	ASO	Exon45	杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥	iv
Lumasiran	Oxlumo	2021	siRNA	HAO1	原發(fā)性高草酸尿癥1型	sc
Vutrisiran	AMVUTTRA	2022	siRNA	TTR	遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性	sc
Tofersen	QALSODY	2023	ASO	SOD1	肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ALS）	itt
Avacincaptad  pegol	Izervay	2023	Aptamer	C5	地圖樣萎縮	ivt
Nedosiran	Rivfloza	2023	siRNA	LDH	原發(fā)性高尿酸血癥	sc
Eplontersen	Wainua	2023	ASO	TTR	遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性	sc

 

注：“*”表示僅獲得EMA批準(zhǔn)上市。ivt，玻璃體注射；itt，鞘內(nèi)注射（intrathecal）。

 

CMV，巨細(xì)胞病毒；VEGF，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；ApoB，載脂蛋白B；Exon，外顯子；SMN2，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活蛋白2；PAI-1，纖溶酶原激活物抑制劑-1；tPA，組織型纖溶酶原激活劑；vWF，血管性血友病因子；TTR，轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白；ApoC3，載脂蛋白C3；ALAS1，5'-氨基乙酰丙酸合酶1；PCSK9，前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9；HAO1，羥基酸氧化酶1；SOD1，超氧化物歧化酶1；C5，補(bǔ)體蛋白C5；LDH，乳酸脫氫酶。

 

2.2已上市ONTs非臨床和臨床安全性研究結(jié)果及相關(guān)性分析

根據(jù)FDA審評(píng)報(bào)告和說(shuō)明書，本文對(duì)FDA已批準(zhǔn)上市的ONTs非臨床毒性表現(xiàn)和臨床常見不良反應(yīng)進(jìn)行了匯總（見表2）。ONTs在非臨床研究中常見注射部位和高暴露器官的毒性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為注射部位反應(yīng)、肝臟和腎臟嗜堿性顆粒聚集和空泡化等；并可見藥理學(xué)相關(guān)指標(biāo)的改變。研究表明，嗜堿性顆粒聚集是寡核苷酸被遞送到高暴露器官后，分布到具有吞噬活性的細(xì)胞（如肝枯否細(xì)胞和腎臟近曲小管上皮細(xì)胞）中，經(jīng)蘇木精染色后在顯微鏡下的表現(xiàn)[14]，免疫組化和電鏡觀察對(duì)該結(jié)果進(jìn)行了確認(rèn)[13]；各種大小的空泡與嗜堿性顆粒聚集通常發(fā)生在胞漿的同一區(qū)域，推測(cè)空泡的形成與溶酶體中局部高濃度的寡核苷酸引起的滲透不平衡所導(dǎo)致的膜結(jié)合的溶質(zhì)聚集物膨脹有關(guān)[15]。

表２　已上市的部分ONTs非臨床毒性表現(xiàn)和臨床常見不良反應(yīng)

臨床試驗(yàn)中常見的不良反應(yīng)包括注射部位反應(yīng)、輸液相關(guān)反應(yīng)、肝損傷和腎臟毒性等。通過(guò)比較這些ONTs的非臨床毒性表現(xiàn)和臨床常見不良反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，非臨床研究較好地預(yù)測(cè)了多數(shù)已批準(zhǔn)ONTs出現(xiàn)的臨床不良反應(yīng)。如經(jīng)玻璃體注射（ivt）的Fomivirsen在非臨床和臨床研究中均可見眼部炎癥；Inotersen在動(dòng)物和人體中均可見明顯的血小板減少；Nusinersen在非臨床研究中可見神經(jīng)元病變，在臨床試驗(yàn)出現(xiàn)頭痛等不良反應(yīng)等。值得關(guān)注的是，由于非臨床安全性試驗(yàn)中所采用的是健康動(dòng)物且檢測(cè)手段有限，某些可能在患者中出現(xiàn)的不良反應(yīng)較難通過(guò)動(dòng)物模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，需要在臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步評(píng)估。

綜上，ONTs的非臨床安全性評(píng)價(jià)包括對(duì)在靶毒性和脫靶毒性的考察，可以對(duì)臨床不良反應(yīng)的可能性和風(fēng)險(xiǎn)程度進(jìn)行預(yù)測(cè)。

 

3.      ONTs非臨床安全性評(píng)價(jià)研究策略

與其他藥物一樣，非臨床安全性研究貫穿于ONTs藥物研發(fā)的全生命周期。早期發(fā)現(xiàn)階段進(jìn)行脫靶效應(yīng)評(píng)估有助于確定成藥性好的臨床前候選分子；開發(fā)階段進(jìn)行系統(tǒng)的非臨床安全性評(píng)價(jià)對(duì)于優(yōu)化制劑處方、指導(dǎo)臨床給藥方案的制定、識(shí)別臨床不良反應(yīng)或風(fēng)險(xiǎn)具有重要價(jià)值，并有助于提高臨床試驗(yàn)申請(qǐng)成功率[7]。因此，制定合理的非臨床研究策略至關(guān)重要。

 

3.1早期發(fā)現(xiàn)階段進(jìn)行多層級(jí)脫靶效應(yīng)評(píng)估,見圖1

 

 

ONTs技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，但同時(shí)也存在一定的脫靶風(fēng)險(xiǎn)，如免疫刺激反應(yīng)、血小板減少、肝臟和腎臟毒性等。為在早期發(fā)現(xiàn)階段對(duì)可能的脫靶毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜医Y(jié)合目前ASO的研究現(xiàn)狀和趨勢(shì)提出了一套系統(tǒng)的候選分子多層級(jí)脫靶效應(yīng)評(píng)估策略[6]。本文參考上述思路并基于筆者的研究經(jīng)驗(yàn)總結(jié)了在早期發(fā)現(xiàn)階段對(duì)不同類型的ONTs候選分子（主要為ASO和siRNA）進(jìn)行脫靶風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的策略。

首先，利用生物信息學(xué)工具從全轉(zhuǎn)錄組中預(yù)測(cè)可能與候選分子發(fā)生雜交的非目標(biāo)序列，評(píng)估其潛在脫靶風(fēng)險(xiǎn)或篩選出特異性高的候選分子；對(duì)于存在與非目標(biāo)序列發(fā)生雜交的候選分子，通過(guò)體外試驗(yàn)比較該分子與目標(biāo)序列和非目標(biāo)序列的活性差異并確立安全活性窗口；對(duì)安全活性窗口較窄的分子進(jìn)行更全面的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)合非目標(biāo)序列的表達(dá)水平、生物學(xué)功能等評(píng)估脫靶效應(yīng)可能產(chǎn)生的影響，并在后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步的脫靶風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

此外，除了雜交依賴型脫靶毒性外，序列或化學(xué)修飾相關(guān)的雜交非依賴型毒性也是值得關(guān)注的內(nèi)容。例如，ASO藥物的PS修飾本身可刺激免疫和激活補(bǔ)體，而中性骨架則沒(méi)有這種效應(yīng)；凝血時(shí)間延長(zhǎng)和血小板減少等毒性與化學(xué)修飾關(guān)系不大，更多與核苷酸序列本身相關(guān)；高親和力化學(xué)修飾，如鎖核酸（locked nucleic acid, LNA）更容易導(dǎo)致肝臟和腎臟的亞急性毒性。因此，在篩選策略上，應(yīng)該根據(jù)候選分子的化學(xué)修飾和設(shè)計(jì)，優(yōu)先評(píng)估與之最相關(guān)的潛在脫靶毒性。

3.2開發(fā)階段開展系統(tǒng)非臨床研究

對(duì)于ONTs，非臨床研究的核心目標(biāo)是全面了解其安全性特征，以支持臨床開發(fā)和上市。建議參考ICH S6（R1）開展在靶毒性評(píng)價(jià)；對(duì)于脫靶毒性，建議采用生物信息學(xué)和人源細(xì)胞體外基因表達(dá)分析評(píng)估雜交依賴型脫靶毒性，參考化學(xué)藥物的方法評(píng)價(jià)雜交非依賴型脫靶毒性。非臨床評(píng)價(jià)除了常見的考慮因素（如相關(guān)種屬選擇、給藥途徑和劑量/暴露量）外，還應(yīng)關(guān)注藥理學(xué)放大效應(yīng)和替代分子的應(yīng)用，毒理學(xué)研究需要根據(jù)相關(guān)適應(yīng)癥或擬定的給藥方案進(jìn)行設(shè)計(jì)。

目前，我國(guó)尚無(wú)專門針對(duì)ONTs非臨床研究的指導(dǎo)原則，可參考ICH M3(R2)等指南并結(jié)合ONTs產(chǎn)品特點(diǎn)開展必要的毒性試驗(yàn)。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)ONTs的監(jiān)管經(jīng)驗(yàn)與化學(xué)藥物相似，主要包括安全藥理學(xué)、一般毒理學(xué)、遺傳毒性、生殖毒性、致癌性試驗(yàn)及其他與產(chǎn)品特性相關(guān)的毒性試驗(yàn)等。由于ONTs具有某些治療用生物制品的特征，ICH S6（R1）中的某些建議有助于指導(dǎo)非臨床研究的開展。實(shí)際試驗(yàn)中，應(yīng)根據(jù)ONTs的序列、化學(xué)修飾和制劑處方制定具體的非臨床研究策略。此外，對(duì)于動(dòng)物種屬的選擇是該類藥物非臨床研究的重要內(nèi)容，將在第4部分進(jìn)行詳述。

 

4.臨床安全性評(píng)價(jià)研究?jī)?nèi)容和關(guān)注點(diǎn)

4.1動(dòng)物種屬的選擇

根據(jù)上文所述，ONTs的毒性分為在靶毒性和脫靶毒性。為了全面評(píng)價(jià)脫靶毒性，建議采用嚙齒類和非嚙齒類2種動(dòng)物種屬；這2種動(dòng)物種屬中至少有1種具有藥理學(xué)活性，以便對(duì)在靶毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)[5]。根據(jù)實(shí)際案例以及日本指導(dǎo)原則，當(dāng)無(wú)藥理學(xué)相關(guān)種屬時(shí)，可僅在1種動(dòng)物種屬中使用替代分子評(píng)價(jià)在靶毒性[5]。與替代分子相關(guān)的毒理學(xué)表現(xiàn)通常包括在靶效應(yīng)、雜交依賴型和雜交非依賴型脫靶效應(yīng)。由于序列不同于臨床分子，替代分子脫靶效應(yīng)不代表臨床分子的安全性，應(yīng)注意區(qū)分替代分子的在靶毒性和脫靶毒性[5]。

表3對(duì)已上市ONTs非臨床研究一般毒理學(xué)試驗(yàn)所用動(dòng)物種屬進(jìn)行了匯總。這些藥物均在猴體內(nèi)具有藥理學(xué)活性，在嚙齒類動(dòng)物中是否具有活性取決于其核苷酸序列。根據(jù)各自的藥理學(xué)活性特點(diǎn)，均采用至少1種相關(guān)種屬考察在靶毒性，同時(shí)選擇合適的動(dòng)物種屬評(píng)估其脫靶毒性。如Inotersen和Patisiran僅在食蟹猴體內(nèi)有藥理學(xué)活性，一般毒性試驗(yàn)中選擇食蟹猴作為相關(guān)種屬考察臨床分子的在靶毒性，選擇嚙齒類動(dòng)物評(píng)估臨床分子的脫靶毒性；Lumasiran在嚙齒類動(dòng)物和猴體內(nèi)均具有藥理學(xué)活性，選擇大鼠和食蟹猴考察了臨床分子的毒性特征，包括在靶毒性和脫靶毒性。

綜上，ONTs非臨床研究應(yīng)兼顧在靶毒性和脫靶毒性的考察，選擇2種動(dòng)物種屬，其中至少在1種動(dòng)物種屬中具有藥理學(xué)活性。

表3 已上市ONTs一般毒理學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物種屬匯總

類別	通用名	給藥途徑	具有藥理學(xué)活性 動(dòng)物種屬	一般毒理學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物種屬
				小鼠	大鼠	兔	猴
ASO	Fomivirsen	ivt	兔、猴	√	×	√	√
	Mipomersen	sc	猴	√	×	×	√
	Eteplirsen	iv	猴	√	×	×	√
	Nusinersen	itt	猴	√	×	×	√
	Inotersen	sc	猴	√	√	×	√
	Volanesorsen	sc	猴	√	√	×	√
	Golodirsen	iv	大鼠、猴	√	√	×	√
	Viltolarsen	iv	猴	√	×	×	√
	Casimersen	iv	猴	√	√	×	√
	Tofersen	itt	猴	√	√	×	√
	Eplontersen	sc	猴	√	×	×	√
siRNA	Patisiran	iv	猴	×	√	×	√
	Givosiran	sc	大鼠、猴	×	√	×	√
	Inclisiran	sc	大鼠、猴	×	√	×	√
	Lumasiran	sc	嚙齒類、猴	√	√	×	√
	Vutrisiran	sc	猴	×	√	×	√
	Nedosiran	sc	猴	√	×	√	√

 

4.2安全藥理學(xué)試驗(yàn)

建議參考ICH S7A《人用藥物安全藥理學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)原則》對(duì)重要生理功能（如心血管、呼吸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)）的非預(yù)期影響進(jìn)行評(píng)價(jià)，通常情況下可考慮采用整合試驗(yàn)的方式，而不是開展單獨(dú)的安全藥理學(xué)試驗(yàn)。由于ONTs不太可能作用于hERG等離子通道，開展體外hERG試驗(yàn)意義不大[5,16,17]。如果在研發(fā)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了體內(nèi)心血管相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，可能需要開展針對(duì)性的體外研究。

Eteplirsen在相關(guān)試驗(yàn)中可見對(duì)心血管和神經(jīng)元的影響，Nusinersen因廣泛分布于脊髓和大腦，基于風(fēng)險(xiǎn)考慮，二者開展了單獨(dú)的安全藥理學(xué)試驗(yàn)。除Fomivirsen外，已上市的所有ASO和siRNA均開展了安全藥理學(xué)試驗(yàn)，但并非所有藥物均進(jìn)行了hERG試驗(yàn)（如Givosiran、Inclisiran、Lumasiran、Vutrisiran、Fomivirsen、Nusinersen、Eplontersen未開展該試驗(yàn)）。

4.3單次給藥毒性試驗(yàn)

日本指導(dǎo)原則中提及如果可從劑量遞增試驗(yàn)、短期劑量范圍探索試驗(yàn)、藥理學(xué)試驗(yàn)或重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中獲得急性毒性信息，可不開展單獨(dú)的單次給藥毒性試驗(yàn)，這與ICH M3 (R2)中的建議一致。ICH S6 (R1)中也提到，作為藥理學(xué)或動(dòng)物模型有效性試驗(yàn)的一部分，通過(guò)進(jìn)行單次給藥毒性試驗(yàn)可收集到劑量-反應(yīng)關(guān)系的信息。

鑒于ONTs在組織中通常具有較長(zhǎng)的半衰期，非臨床研究中通常采用較長(zhǎng)的給藥間隔。Eteplirsen、Inotersen、Golodirsen和Lumasiran等已上市藥物均未開展單次給藥毒性試驗(yàn)，通過(guò)其它相關(guān)試驗(yàn)對(duì)單次給藥毒性進(jìn)行了評(píng)估。

4.4重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)

重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)重點(diǎn)評(píng)估ONTs在特定器官的蓄積情況和毒性反應(yīng)。研究表明，一些經(jīng)化學(xué)修飾、具有抗核酸酶活性的ONTs，長(zhǎng)期給藥后可能會(huì)在特定組織如肝、腎等蓄積并產(chǎn)生毒性反應(yīng)[18]，非臨床研究中常見高暴露靶器官的毒性反應(yīng)，如肝腎可見嗜堿性顆粒聚集和空泡化等[15]。

大鼠經(jīng)sc重復(fù)給予Lumasiran，在20、50和200 mg·kg-1劑量下均可見肝細(xì)胞輕微至重度空泡化，枯否細(xì)胞色素輕微增加和/或肝細(xì)胞輕度到中度核腫大，腎臟輕微至輕度嗜堿性顆粒和/或少量腎小管細(xì)胞空泡化；上述肝臟和腎臟相關(guān)改變均為非不良反應(yīng)。綜合死亡率、臨床觀察、體重、生化指標(biāo)等各項(xiàng)指標(biāo)，未見不良反應(yīng)劑量（NOAEL）為200 mg·kg-1。食蟹猴經(jīng)sc重復(fù)給予Lumasiran，30 mg·kg-1劑量下可見堿性磷酸酶輕微升高，100和300 mg·kg-1劑量下可見肝臟枯否細(xì)胞輕微嗜堿性顆粒，由于程度較輕且未見對(duì)動(dòng)物健康狀況的影響，NOAEL為300 mg·kg-1。與Lumasiran類似，其它已上市藥物的重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)至少采用2種動(dòng)物種屬進(jìn)行，通過(guò)臨床病理學(xué)、組織病理學(xué)和毒代動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，考察在不同劑量下的毒性反應(yīng)特征和劑量-反應(yīng)關(guān)系。

4.5遺傳毒性試驗(yàn)

對(duì)于含化學(xué)修飾的ONTs，應(yīng)參考ICH S2 (R1)進(jìn)行遺傳毒性試驗(yàn)。

由于ASO和siRNA藥物均進(jìn)行了不同程度的化學(xué)修飾，故已上市藥物開展了遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)組合試驗(yàn)。調(diào)研顯示，已上市ONTs在Ames、體外染色體畸變和體內(nèi)微核試驗(yàn)中均為陰性結(jié)果。盡管如此，隨著更多新化學(xué)修飾方式的引入，尚不能忽視ONTs潛在的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。某些經(jīng)降解后可整合入DNA的化學(xué)修飾寡核苷酸也可能具有遺傳毒性[19]。

4.6生殖毒性試驗(yàn)

建議參考ICH S5 (R3)并結(jié)合適應(yīng)癥人群進(jìn)行ONTs的生殖毒性（developmental and reproductive toxicity，DART）試驗(yàn)。通常，采用嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行生育力與早期胚胎發(fā)育毒性（fertility and early embryonic development，F(xiàn)EED）試驗(yàn)和圍產(chǎn)期發(fā)育毒性（pre-and postnatal development，PPND）試驗(yàn)，采用嚙齒類和兔進(jìn)行胚胎-胎仔發(fā)育毒性（embryo fetal development，EFD）試驗(yàn)。日本指導(dǎo)原則建議，當(dāng)臨床分子在嚙齒類和兔中無(wú)藥理學(xué)活性時(shí)，推薦在嚙齒類或兔中采用替代分子進(jìn)行EFD試驗(yàn)，不推薦在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中進(jìn)行EFD試驗(yàn)[6]。如證據(jù)權(quán)重分析（如作用機(jī)制、基因修飾動(dòng)物的表型數(shù)據(jù)、同類分子的類別效應(yīng)等）結(jié)果提示供試品存在對(duì)生育力或妊娠結(jié)局有明顯的不利影響，足以提示存在生殖毒性風(fēng)險(xiǎn)，則不需要開展額外的DART試驗(yàn)。關(guān)于DART試驗(yàn)的時(shí)間安排，參考 ICH M3(R2)。

表4對(duì)已上市ONTs DART試驗(yàn)類型和所用動(dòng)物種屬進(jìn)行了匯總。Inotersen、Volanesorsen和Patisiran 等的相關(guān)種屬僅為猴，均采用嚙齒類動(dòng)物開展了臨床分子和替代分子的FEED和PPND試驗(yàn)；除mipomersen、nusinersen、inotersen、volanesorsen、tofersen、patisiran、nedosiran 、givosiran、inclisiran、lumasiran和vutrisiran同時(shí)采用嚙齒類和兔開展EFD試驗(yàn)（mipomersen、nusinersen、inotersen、volanesorsen、tofersen和eplontersen采用 Ⅰ/II段生殖試驗(yàn)組合的方式進(jìn)行評(píng)價(jià)），其余僅采用嚙齒類開展EFD試驗(yàn)。兔EFD試驗(yàn)均采用了臨床分子，主要目的可能在于用臨床分子在第二個(gè)種屬中考察因脫靶毒性帶來(lái)的生殖毒性?？紤]到杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）患者主要為男性，Eteplirsen、Golodirsen和Casimersen一般毒理學(xué)重復(fù)給藥中均未觀察到對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的影響，故均未開展DART試驗(yàn)。Viltolarsen的適應(yīng)癥也為DMD，僅進(jìn)行了雄性小鼠的FEED試驗(yàn)。

4.7致癌性試驗(yàn)

建議參考ICH S1A、ICH S1B和ICH S1C (R2)評(píng)估ONTs是否需要以及如何設(shè)計(jì)致癌性試驗(yàn)。日本指導(dǎo)原則提出，當(dāng)由于作用機(jī)制（如免疫抑制）存在致癌性擔(dān)憂，或遺傳毒性試驗(yàn)、重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)或雜交依賴型脫靶毒性結(jié)果提示存在致癌性擔(dān)憂，則較難通過(guò)致癌性試驗(yàn)排除這種擔(dān)憂，而是應(yīng)該在考慮臨床風(fēng)險(xiǎn)和獲益的情況下適當(dāng)?shù)貍鬟_(dá)致癌性風(fēng)險(xiǎn)[6]。

表5對(duì)已上市ONTs致癌性試驗(yàn)的完成情況進(jìn)行了匯總。Eteplirsen、Nusinersen和Lumasiran等在提交上市申請(qǐng)（NDA）時(shí)未完成致癌性試驗(yàn)，一方面是因?yàn)楝F(xiàn)有的數(shù)據(jù)未提示致癌性風(fēng)險(xiǎn)，另一方面是結(jié)合臨床獲益-風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估認(rèn)為可將致癌性試驗(yàn)可作為上市后要求；由于Inotersen在肝臟和腎臟中存在高暴露，Patisiran在雄性動(dòng)物中可見細(xì)支氣管肺泡腺瘤，在NDA時(shí)完成了致癌性試驗(yàn)，其中Inotersen采用了替代分子進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

4.8局部耐受性試驗(yàn)

需評(píng)價(jià)品種制劑給藥的局部耐受性，可在重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中伴隨，除非有單獨(dú)開展的理由。FDA批準(zhǔn)上市的ONTs均在重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中伴隨考察了對(duì)給藥部位的耐受性。

4.9免疫毒性試驗(yàn)

某些類型的 ONTs 已知會(huì)激活先天免疫系統(tǒng)（如巨噬細(xì)胞、組織細(xì)胞、補(bǔ)體）。盡管通常無(wú)需開展專門的免疫毒性評(píng)估，但在一般毒性研究中評(píng)估 ONTs 誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)（如細(xì)胞因子、補(bǔ)體）可以提供有用的信息?？蓪⒚庖叨拘栽囼?yàn)整合在重復(fù)給藥毒性等試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)價(jià)，相關(guān)要求參考ICH S8。

Eteplirsen、Nusinersen、Inotersen和Patisiran在重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中進(jìn)行了免疫毒性試驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，如白細(xì)胞系相關(guān)指標(biāo)（Eteplirsen和Nusinersen）、C反應(yīng)蛋白（Inotersen）、α1酸性糖蛋白（Patisiran）、免疫器官（淋巴結(jié)、胸腺、脾臟）組織病理學(xué)（Patisiran）、免疫細(xì)胞表型分析（Eteplirsen和Inotersen）等。

4.10光安全性評(píng)價(jià)

對(duì)于化學(xué)修飾的核酸如存在特殊的光安全性擔(dān)憂，應(yīng)參考ICH S10進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)目前已上市產(chǎn)品的文獻(xiàn)資料，均未見光安全性相關(guān)評(píng)價(jià)，因此，光安全性評(píng)價(jià)建議具體情況具體分析。

4.11雜質(zhì)限度的界定

ONTs的雜質(zhì)分為寡核苷酸有關(guān)物質(zhì)、有機(jī)小分子雜質(zhì)、殘留溶劑和元素雜質(zhì)。小分子雜質(zhì)、殘留溶劑和元素雜質(zhì)的評(píng)價(jià)參考ICH Q3和ICH M7；由于理化性質(zhì)相似，寡核苷酸有關(guān)物質(zhì)通常難以單獨(dú)分離，較難參考ICH Q3A進(jìn)行界定，因此對(duì)于該類雜質(zhì)的安全性評(píng)價(jià)應(yīng)基于原料藥或制劑的研究結(jié)果（如雜質(zhì)譜、毒性譜等）[5]。關(guān)于脫靶毒性的生物信息學(xué)分析可用于評(píng)估寡核苷酸有關(guān)物質(zhì)的雜交依賴型脫靶毒性，如在生物信息學(xué)分析中包含了錯(cuò)配序列，可以假定已對(duì)主要寡核苷酸有關(guān)物質(zhì)的雜交依賴型脫靶效應(yīng)進(jìn)行了研究。如每種寡核苷酸有關(guān)物質(zhì)的含量遠(yuǎn)低于活性成分，則評(píng)價(jià)其雜交依賴型脫靶效應(yīng)的意義不大[5]。對(duì)于ONTs，應(yīng)盡可能在生產(chǎn)過(guò)程中減少雜質(zhì)的產(chǎn)生，并根據(jù)藥學(xué)和非臨床研究數(shù)據(jù)、文獻(xiàn)資料綜合評(píng)價(jià)在人體中的安全性。

在Vutrisiran的非臨床研究中，共涉及6批樣品，其中3批含特定雜質(zhì)（＞ 0.1%），NOAEL劑量下的雜質(zhì)水平支持了臨床樣品雜質(zhì)限度的制定。

4.12代謝產(chǎn)物和/或降解產(chǎn)物的安全性

研究顯示，天然核苷酸很容易經(jīng)各種途徑清除，不太可能形成反應(yīng)性中間體或破壞天然核苷酸儲(chǔ)庫(kù)和再循環(huán)途徑[20]；某些化學(xué)修飾，如PS和MOE不產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物，這可減少對(duì)部分ONTs代謝產(chǎn)物的評(píng)價(jià)需求，而對(duì)于新的或不明確的化學(xué)修飾，可能需要進(jìn)行更廣泛的代謝研究[7]。因此，對(duì)于可被核酸酶降解的天然核苷酸，其代謝產(chǎn)物或降解產(chǎn)物的安全性無(wú)需特別關(guān)注；但對(duì)于含有化學(xué)修飾的代謝產(chǎn)物和降解產(chǎn)物，需參考ICH M3 (R2)進(jìn)行非臨床安全性評(píng)價(jià)。

Givosiran是通過(guò)將GalNAc配體與siRNA偶聯(lián)而實(shí)現(xiàn)肝臟特異性遞送的siRNA藥物，主要化學(xué)修飾為PS骨架、2'-氟（2'F）和MOE。試驗(yàn)顯示，Givosiran在不同種屬血清中的穩(wěn)定性相似，正義鏈比反義鏈更穩(wěn)定，主要的活性代謝產(chǎn)物為AS(N-1)3’ Givosiran。大鼠（10 mg·kg-1）和猴（30 mg·kg-1）經(jīng)sc給藥后，血漿中唯一活性代謝產(chǎn)物為AS(N-1)3’ Givosiran，暴露量占總物質(zhì)的百分比分別約為17%和42%；臨床試驗(yàn)中，Givosiran以2.5 mg·kg-1每月一次sc給藥后，血漿中主要代謝產(chǎn)物為AS(N-1)3’ Givosiran，穩(wěn)態(tài)暴露量占總物質(zhì)的百分比約為33%。在大鼠和猴重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中，AS(N-1)3’ Givosiran的系統(tǒng)暴露量顯著高于臨床劑量下的暴露量（表6）。因此，大鼠和猴重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)充分評(píng)價(jià)了活性代謝產(chǎn)物AS(N-1)3’ Givosiran的安全性[21]。

表6 非臨床和臨床試驗(yàn)中Givosiran主要代謝產(chǎn)物暴露情況匯總

 

4.13針對(duì)遞送系統(tǒng)的評(píng)價(jià)

對(duì)于遞送系統(tǒng)制劑，評(píng)價(jià)ONTs最終制劑的安全性是非常重要的，特別是當(dāng)采用了LNP等特殊遞送系統(tǒng)時(shí)。ONTs的遞送系統(tǒng)在很大程度上影響著其安全性和有效性，應(yīng)根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)和已有的信息，采用適當(dāng)?shù)亩拘栽囼?yàn)評(píng)價(jià)ONTs載體材料（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖等）的安全性[5]。

Patisiran是第一個(gè)批準(zhǔn)的LNP包裹的siRNA藥物，LNP中含有2種新的成分（DLin-MC3-DMA和PEG2000-C-DMG）。針對(duì)該LNP，在支持IND和NDA的研究中分別進(jìn)行了體外hERG試驗(yàn)、一般毒理學(xué)試驗(yàn)、體內(nèi)微核試驗(yàn)和生殖毒性試驗(yàn)（表7）。

 

5.結(jié)語(yǔ)與展望

作為一種新興的治療方法，ONTs具有巨大的應(yīng)用前景，有望在更多的罕見性疾病、心血管疾病、代謝性疾病、傳染性疾病和癌癥領(lǐng)域展現(xiàn)出臨床價(jià)值。ONTs的毒性取決于多種因素，如序列設(shè)計(jì)、化學(xué)修飾、給藥方案（給藥途徑、劑量、持續(xù)時(shí)間）等。最常見的改變是肝臟、腎臟等高暴露組織的病理學(xué)變化和免疫反應(yīng)[6,8,9]。已上市產(chǎn)品的非臨床研究較好地支持了臨床試驗(yàn)的開展，其非臨床研究經(jīng)驗(yàn)為新的ONTs的開發(fā)提供了參考。在深度匯總和解讀已上市藥物非臨床研究案例的基礎(chǔ)上，本文根據(jù)國(guó)外監(jiān)管機(jī)構(gòu)和寡核苷酸安全工作組（OSWG）發(fā)布的相關(guān)建議和共識(shí)文件[22-24]，對(duì)ONTs非臨床安全性評(píng)價(jià)的策略和技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行了闡述：1）在早期開發(fā)階段，開展多層級(jí)脫靶效應(yīng)評(píng)估，充分利用生物信息學(xué)和體外模型對(duì)候選序列進(jìn)行篩選，評(píng)估其與非靶標(biāo)序列發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)的可能性。2）在開發(fā)階段，分階段開展支持IND和NDA的一般毒理學(xué)試驗(yàn)，并從兼顧在靶毒性和脫靶毒性評(píng)價(jià)的角度考慮非臨床安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)動(dòng)物種屬的選擇；結(jié)合供試品結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、化學(xué)修飾和遞送載體開展相應(yīng)的遺傳毒性、生殖毒性和致癌性試驗(yàn)。3）關(guān)注對(duì)代謝產(chǎn)物、雜質(zhì)和/或降解產(chǎn)物的安全性評(píng)估。通過(guò)本文，期望為國(guó)內(nèi)ONTs研發(fā)提供參考和借鑒。

隨著對(duì)非編碼RNA的深入認(rèn)識(shí)，預(yù)計(jì)未來(lái)將會(huì)有更多類型的ONTs進(jìn)入臨床試驗(yàn)或上市。同時(shí)，需要考慮如何應(yīng)對(duì)靶細(xì)胞遞送不足和脫靶效應(yīng)等挑戰(zhàn)[25]。合理的序列設(shè)計(jì)、算法、化學(xué)修飾和遞送載體至關(guān)重要，減少脫靶效應(yīng)和更深入地理解毒性機(jī)制有助于避免后期開發(fā)過(guò)程中的安全性問(wèn)題，提高開發(fā)成功率。此外，新型體外模型的開發(fā)有助于提高預(yù)測(cè)性和敏感度。非臨床評(píng)價(jià)應(yīng)在遵循指導(dǎo)原則的同時(shí)，結(jié)合具體產(chǎn)品的特點(diǎn)和臨床適應(yīng)癥進(jìn)行個(gè)性化考量。監(jiān)管機(jī)構(gòu)也在不斷積累和完善審評(píng)實(shí)踐，為ONTs的研發(fā)提供良好的指引。

 

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