您當(dāng)前的位置：檢測(cè)資訊 > 科研開(kāi)發(fā)
嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2024-12-20 18:12
大麻是桑科大麻屬一年生直立草木植物，可分離出大麻素，主要成分為大麻酚、大麻二酚和四氫大麻酚，總量占大麻素提取物的40%以上。大麻在臨床上有鎮(zhèn)痛、抗嘔吐、抗腫瘤、抗菌以及抗癲癇和鎮(zhèn)靜等功效，而且大麻耐受性高，在醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前，大麻在食品中的應(yīng)用在很多國(guó)家都已合法化，但是被我國(guó)法律法規(guī)禁止。由于大麻在國(guó)外多使用在烘焙食品中，隨著進(jìn)口食品的增加，添加了大麻的食品的輸入風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。因此，需要開(kāi)發(fā)高效快速的檢測(cè)食品中大麻的方法，以保障消費(fèi)者的健康安全。
大麻酚類化合物的檢測(cè)方法主要有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法。液相色譜法雖然應(yīng)用較普及、適用范圍廣，但是檢測(cè)器選擇性低、檢出限高且檢測(cè)結(jié)果容易受雜質(zhì)影響，需要進(jìn)行較繁瑣的凈化前處理，試驗(yàn)過(guò)程耗時(shí)耗力。質(zhì)譜法選擇性高，對(duì)前處理要求低，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物含量較低的樣品的高通量檢測(cè)。本工作采用分散固相萃取法進(jìn)行前處理，超高效液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UHPLC-Q-TOF/MS）定性定量檢測(cè)膨化食品中3種大麻酚類化合物，可為相關(guān)化合物測(cè)定提供一定參考。
1、 試驗(yàn)方法
取粉碎后的樣品置于離心管中，依次加入水、乙腈、無(wú)水硫酸鎂和氯化鈉，渦旋振蕩，離心后取上清液置于含有C18和PSA的離心管中，渦旋，然后離心，上清液過(guò)濾膜，濾液按照儀器工作條件測(cè)定。
2、 結(jié)果與討論
2.1 儀器工作條件的優(yōu)化
大麻酚、大麻二酚和四氫大麻酚的結(jié)構(gòu)上均含有苯環(huán)和酚羥基，苯環(huán)上的大π鍵電子云密度較大，加強(qiáng)了酚羥基上氧原子的電負(fù)性，從而使酚羥基更易失去H+，在ESI−和堿性洗脫條件下，這些目標(biāo)物更易形成穩(wěn)定且豐度較高的母離子[M−H]−，且母離子精確m/z的相對(duì)誤差絕對(duì)值均不大于1.0×10−6；調(diào)節(jié)去簇電壓，使3種目標(biāo)物的母離子豐度達(dá)到最佳，并采用母離子定量（峰面積）和定性（精確m/z）。調(diào)節(jié)碰撞能量，使二級(jí)碎片離子盡可能多且豐度較高，選擇豐度較高的碎片離子輔助定性，其中互為同分異構(gòu)體的大麻二酚和四氫大麻酚需要添加保留時(shí)間進(jìn)行定性。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。
表1 質(zhì)譜參數(shù)
大麻二酚和四氫大麻酚互為同分異構(gòu)體，通過(guò)調(diào)節(jié)梯度洗脫程序，可實(shí)現(xiàn)二者的基線分離。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子色譜圖見(jiàn)圖1。
2.2 基于單因素法的前處理?xiàng)l件的優(yōu)化
2.2.1 提取溶劑及其用量
以加標(biāo)陰性米餅樣品為待測(cè)對(duì)象，試驗(yàn)考察了分別以甲醇、乙腈和乙酸乙酯為提取溶劑時(shí)對(duì)3種目標(biāo)物回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。
結(jié)果顯示：乙酸乙酯對(duì)3種目標(biāo)物的提取率較低，回收率在50.0%~65.0% 內(nèi)，可能原因?yàn)楹蟹恿u基的大麻酚類化合物具有一定的親水性，不易被極性較低的乙酸乙酯提??；甲醇的回收率也較低，這是由于甲醇與水之間的氫鍵作用較強(qiáng)，部分有機(jī)相未在加入鹽后析出，導(dǎo)致提取液中目標(biāo)物變少，且雜質(zhì)增加，基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)；乙腈提取率最高，可能原因是乙腈的極性介于甲醇與乙酸乙酯之間，與3種大麻酚類化合物的極性相似，且與水之間的氫鍵作用弱于甲醇的，3種目標(biāo)物可在鹽析時(shí)隨乙腈相析出，雜質(zhì)提取量減少，基質(zhì)效應(yīng)降低。因此，試驗(yàn)選擇的提取溶劑為乙腈。
試驗(yàn)進(jìn)一步比較了乙腈用量分別為5，10，15mL時(shí)上述加標(biāo)樣品中目標(biāo)物回收率的變化。結(jié)果顯示：乙腈用量為5mL時(shí)，3種目標(biāo)物的回收率低于60.0%；乙腈用量為10mL和15mL時(shí)，3種目標(biāo)物的回收率均能達(dá)到80.0%以上。為了節(jié)省溶劑，試驗(yàn)選擇的乙腈用量為10mL。
2.2.2 提取方式
試驗(yàn)對(duì)比了超聲、渦旋振蕩和水平振搖等3種提取方式下2.2.1節(jié)加標(biāo)樣品中目標(biāo)物回收率的變化，結(jié)果見(jiàn)圖3。
由圖3可知，渦旋振蕩提取率最高，水平振搖次之，超聲最低，推測(cè)在鹽析作用下，乙腈相與水相分離，而超聲不能使兩相充分混合。因此，試驗(yàn)選擇的提取方式為渦旋振蕩。
2.2.3 凈化劑及其用量
膨化食品中含有大量的淀粉、糖、油脂以及呈味物質(zhì)，此類雜質(zhì)在提取過(guò)程中會(huì)被大量提取到乙腈相并影響目標(biāo)物的準(zhǔn)確測(cè)定，因此需要對(duì)提取液進(jìn)行凈化。按照試驗(yàn)方法處理2.2.1節(jié)加標(biāo)樣品，并分別以C18、PSA、GCB及中性氧化鋁凈化提取液，3種目標(biāo)物的回收率見(jiàn)圖4。
由圖4可知：以中性氧化鋁和GCB凈化時(shí)，3種目標(biāo)物的回收率較低，可能原因是中性氧化鋁上鋁中心會(huì)與大麻酚化合物上酚羥基相互作用，導(dǎo)致目標(biāo)物吸附，GCB對(duì)具有平面結(jié)構(gòu)的化合物有較強(qiáng)吸附，導(dǎo)致以這二者凈化時(shí)目標(biāo)物回收率降低；以C18和PSA凈化時(shí)，二者所得目標(biāo)物的回收率均較高且相當(dāng)?？紤]到C18主要吸附提取液中的油脂等低極性物質(zhì)，PSA主要吸附糖類或大極性物質(zhì)，二者除雜類型不同，選擇 C18和PSA聯(lián)合凈化，并進(jìn)一步探究二者用量的比例。由于PSA所得目標(biāo)物的回收率稍低于C18的，因此在選擇凈化劑組合用量時(shí)，適當(dāng)降低了PSA的用量，并比較了凈化劑組合分別為100mgC18+20mgPSA、100mgC18+30mgPSA、100mg C18+40mgPSA、200mgC18+20mgPSA、200mgC18+30mgPSA、200mgC18+40mgPSA（分別標(biāo)記為凈化劑組合1#~6#）時(shí)2.2.1節(jié)加標(biāo)樣品中 3種目標(biāo)物回收率的變化，結(jié)果見(jiàn)圖5。
由圖5可知：C18用量為200mg時(shí)，3種目標(biāo)物的回收率明顯高于100mg時(shí)的；PSA用量為20mg時(shí)，3種目標(biāo)物的回收率較低，除雜可能不完全，PSA用量為30，40mg時(shí)的回收率均較高，但是PSA用量為30mg 時(shí)的稍高。因此，試驗(yàn)選擇的C18和PSA用量分別為200mg和30mg。
2.3 基于響應(yīng)面法的凈化劑和提取溶劑用量的優(yōu)化
基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化C18、PSA以及乙腈的用量。以各因素為自變量，四氫大麻酚回收率為考察指標(biāo)，采用Design Expert軟件根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，自變量編碼及水平見(jiàn)表2。
表2 響應(yīng)面試驗(yàn)自變量編碼及水平
按照表2設(shè)計(jì)的響應(yīng)面試驗(yàn)方案，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行三因素三水平共17組試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果
以四氫大麻酚回收率（Y）為考察指標(biāo)，對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合，得到擬合方程（模型）為Y=93.44+1.025A-0.3999B+5.250C+0.4750AB-1.425AC-0.9250BC-6.033A2-5.282B2-8.3325C2，相關(guān)系數(shù)為0.9949，說(shuō)明該模型可以進(jìn)行較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。采用方差分析法（ANOVA）對(duì)模型及各因素進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 響應(yīng)面模型的方差分析結(jié)果
由表4可知，A、C、AC、A2、B2、C2的P值均小于0.05，說(shuō)明這5個(gè)因素對(duì)四氫大麻酚回收率影響顯著；F值與各因素影響程度呈正相關(guān)，比較各因素的F值，可知對(duì)四氫大麻酚回收率影響程度由大到小的因素依次為C、A、B?？紤]到交互因素AC對(duì)四氫大麻酚回收率影響更顯著，進(jìn)一步繪制其響應(yīng)面和等高線圖，結(jié)果見(jiàn)圖6。
基于所建模型，采用Design Expert 軟件預(yù)測(cè)凈化劑和提取溶劑的最佳用量，結(jié)果為C18用量196.3mg，PSA用量26.2mg，乙腈用量11.1mL，該組合條件下四氫大麻酚的理論回收率為93.6%。簡(jiǎn)化試驗(yàn)，將各試劑用量定為 C18用量200mg，PSA用量30mg，乙腈用量10mL，按照1.3節(jié)方法在此條件下進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，以驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，四氫大麻酚的回收率為94.1%，與預(yù)測(cè)值基本一致，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)較準(zhǔn)確。
2.4 基質(zhì)效應(yīng)
考慮到凈化后膨化食品里的淀粉、糖類、油脂等物質(zhì)還會(huì)被提取至有機(jī)相，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度，試驗(yàn)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了探討。分別采用空白米餅、餅干、薯片基質(zhì)溶液和乙腈配制標(biāo)準(zhǔn)溶液系列并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以二者標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值（K）評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。若K值為90.0%~110% 時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，可忽略；若 K值小于90.0% 或大于110%時(shí)，分別存在強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng)或強(qiáng)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)不能忽略。結(jié)果顯示，在米餅、餅干和薯片3種基質(zhì)中，K值分別為76.5％~83.2%、79.9％~ 87.7%和 82.8％~90.9%，基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯。為消除基質(zhì)干擾，試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配法定量。
2.5 工作曲線、檢出限和測(cè)定下限
以基質(zhì)效應(yīng)相對(duì)較嚴(yán)重的空白米餅基質(zhì)溶液配制基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，按照儀器工作條件測(cè)定，以3種目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的母離子峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，3種目標(biāo)物的質(zhì)量濃度均在5.0~200μg·L−1內(nèi)和母離子峰面積呈線性關(guān)系，其他線性參數(shù)見(jiàn)表5。
表5 線性參數(shù)
以3，10倍信噪比（S/N）計(jì)算檢出限（3S/N）和測(cè)定下限（10S/N），結(jié)果分別為10.0，25.0μg·kg−1。
2.6 精密度和回收試驗(yàn)
參考文獻(xiàn)按照試驗(yàn)方法對(duì)陰性米餅進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)量分別為 1，2，10倍測(cè)定下限，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表6。
表6 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
由表6可知，3種目標(biāo)物的回收率為 81.9%~ 94.1%，測(cè)定值的RSD為3.9%~7.3%，方法的準(zhǔn)確度及精密度可滿足膨化食品中3種大麻酚類化合物的日常測(cè)定要求。
2.7 樣品分析
隨機(jī)選擇國(guó)內(nèi)及國(guó)外的3種基質(zhì)樣品各15個(gè)（米餅、餅 干、薯片各5個(gè)），按照試驗(yàn)方法測(cè)定。結(jié)果顯示，在1個(gè)進(jìn)口餅干樣品中檢出了大麻酚（27.8μg·kg−1）、大麻二酚（113μg·kg−1）和四氫大麻酚（30.6μg·kg−1），其他樣品均未檢出這3種大麻酚類化合物。
3、 試驗(yàn)結(jié)論
本工作采用乙腈提取膨化食品中的大麻酚、大麻二酚和四氫大麻酚，PSA和C18聯(lián)合凈化提取液，并采用單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化了提取溶劑和凈化劑的用量；凈化液采用UHPLC-Q-TOF/MS檢測(cè)，3種大麻酚類化合物在8min內(nèi)出峰，互為同分異構(gòu)體的大麻二酚和四氫大麻酚實(shí)現(xiàn)了基線分離，且母離子理論精確m/z與實(shí)測(cè)值相對(duì)誤差較小，可用于3種大麻酚類化合物的準(zhǔn)確定性；以基質(zhì)匹配法定量，可消除基質(zhì)抑制效應(yīng)的干擾，且方法檢出限、準(zhǔn)確度和精密度均較好。以上結(jié)果說(shuō)明本方法可應(yīng)用于膨化食品的批量分析。
作者：郝志明1，馮奎2，肖艷萍1，李冬梅1，李寶玉1，姚小華1，趙培靜3，吳燕燕4
單位：1. 廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院；
2. 佛山象尚食品科技有限公司；
3. 廣東省華微檢測(cè)股份有限公司；
4. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
來(lái)源：《理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)》2024年第10期
來(lái)源：理化檢驗(yàn)化學(xué)分冊(cè)
關(guān)于我們 聯(lián)系我們 營(yíng)業(yè)執(zhí)照 全國(guó)服務(wù)電話：400-818-0021 嘉峪檢測(cè)版權(quán)所有 備案號(hào)：京ICP備14047019號(hào)-2 
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
