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摘  要 / Abstract

 

中草藥目前是化妝品原料添加的研究熱點(diǎn)，鐵皮石斛是我國傳統(tǒng)中藥材，其提取物可作為化妝品原料，具有抗皺緊致作用。目前大多數(shù)提取工藝的產(chǎn)物分子量較大，對(duì)于低分子量鐵皮石斛的功效未見相關(guān)的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察和比較鐵皮石斛提取物中具有保濕和抗皺功效的基因表達(dá)，初步探討其作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)對(duì)保濕因子（AQP-3）、透明質(zhì)酸（HA）和膠原蛋白（COL-I）基因表達(dá)含量進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試結(jié)果表明1%濃度超低分子石斛多糖能夠有效提高這三種基因的表達(dá)含量。超低分子石斛多糖可能通過上調(diào)膠原蛋白和保濕因子的表達(dá)，抑制膠原蛋白降解，改善皮膚屏障和增加皮膚水分，從而減少皮膚老化，發(fā)揮抗皺功效。同時(shí)，與市售鐵皮石斛提取物相比，1%濃度超低分子石斛多糖在細(xì)胞層面具有更好的保濕、抗皺功效。超低分子石斛多糖可作為保濕抗皺的原料，應(yīng)用于皮膚護(hù)理領(lǐng)域。

 

Chinese herbal medicine is currently a hot research topic of cosmetic ingredient additives. Dendrobium officinale is a traditional Chinese herb, its extract can be used as a cosmetic ingredient and has anti-wrinkle and firming effects. Most of the current extraction processes result in products with larger molecular weights. However, there have been no relevant research reports on the efficacy of low molecular weight Dendrobium officinale. This experiment preliminarily explores its mechanism of action by observing and comparing the expression of genes with moisturizing and anti-wrinkle effects of Dendrobium officinale extract. The experiment detected the genes expression levels of the hyaluronic acid (HA), collagen (COL-I), and aquaporin-3 (AQP-3), and the results showed that ultra-low molecular weight Dendrobium officinale polysaccharides (1%) could effectively increase the expression levels of these three genes. Ultra-low molecular weight Dendrobium officinale polysaccharides may exert anti-wrinkle effects by upregulating the expression of collagen and moisturizing factors, inhibiting collagen degradation, improving the skin barrier, increasing skin moisture and thus reducing skin aging. Meanwhile, compared with commercially available Dendrobium officinale extracts, ultra-low molecular weight Dendrobium officinale polysaccharides at a concentration of 1% have better moisturizing and anti-wrinkle effects at the cellular level. Ultra-low molecular weight Dendrobium officinale polysaccharides can be used as moisturizing and anti-wrinkle ingredients and applied to the field of skin care.

 

關(guān) 鍵 詞 / Key words

 

鐵皮石斛；多糖提取物；促膠原生成；抗皺；雙酶解工藝

 

dendrobium officinale; polysaccharide extract; promoting collagen synthesis; anti-wrinkle; dual enzymatic process

 

皮膚皺紋是一系列多因素造成的復(fù)雜過程，導(dǎo)致皮膚某些功能及美學(xué)改變[1]。隨著年齡增長，多種內(nèi)部或外部因素導(dǎo)致表皮細(xì)胞的增殖活性衰退，表皮變薄[2-3]；真皮膠原蛋白纖維的減少以及基質(zhì)金屬蛋白酶活化或增多， 導(dǎo)致膠原蛋白的分解和斷裂，進(jìn)一步引發(fā)真皮膠原蛋白纖維束構(gòu)造紊亂；皮膚中的透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）減少，特別是表皮的保水性變差[4-5]。

 

目前，已經(jīng)有大量的研究發(fā)現(xiàn)多糖具有顯著的抗衰老作用，多糖結(jié)構(gòu)中含有半縮醛羥基，具有還原作用。有些多糖還可以增強(qiáng)皮膚細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性， 從而緩解皮膚氧化損傷， 延緩皮膚衰老[6-9]。近年來的現(xiàn)代藥理藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛具有較強(qiáng)的抗氧化、保濕和抗皺等活性。鐵皮石斛多糖作為鐵皮石斛最主要的活性成分促膠原生成、抗氧化功效有著密切的聯(lián)系[10]。多糖的生物活性與分子結(jié)構(gòu)、主鏈組成、相對(duì)分子量、分支程度、主鏈配置和化學(xué)修飾等密切相關(guān)[11]。故此，多糖的相對(duì)分子量大小會(huì)對(duì)其活性產(chǎn)生一定影響。

 

已經(jīng)有研究表明不同分子量的石斛多糖具有不同的功效， 小分子量的石斛多糖的抗氧化活性更高，這為石斛多糖的抗皺機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[12-13]。本研究采用特定的酶切工藝，制備小分子量3000Da石斛多糖，評(píng)價(jià)其體外的抗皺功效，為后續(xù)超低分子鐵皮石斛多糖作為功效性化妝品添加劑，開發(fā)具有特定功效的化妝品提供了相關(guān)的理論依據(jù)。

 

1、實(shí)驗(yàn)部分

 

1.1 主要材料、實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

 

材料：鐵皮石斛（安徽霍山鐵皮石斛基地，批號(hào)20200403），市售鐵皮石斛提取物（博林生物，批號(hào)20230707）。

 

試劑：胎牛血清（FBS）（美國吉布斯生物科技公司，批號(hào)20230919），果膠酶（實(shí)驗(yàn)室自研，批號(hào)20230302）， 纖維素酶（實(shí)驗(yàn)室自研， 批號(hào)20230317），表皮細(xì)胞生長因子（EGF）（美國吉布斯生物科技公司，批號(hào)20230711），人真皮成纖維細(xì)胞（HSF）（北京伊瑞萊生物，批號(hào)20230313），pH7.4 緩沖溶液（PBS）（美國吉布斯生物科技公司，批號(hào)20230801），高糖培養(yǎng)基（H-DMEM）（美國吉布斯生物科技公司，批號(hào)20230801），RNA 提取試劑盒（上海美基生物，批號(hào)20230519），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本塔克拉生物， 批號(hào)20230519）， 熒光定量PCR 試劑盒（上海碧云天生物，批號(hào)20230512），透明質(zhì)酸ELISA 檢測(cè)試劑盒（上海江萊生物，批號(hào)20230519），I 型膠原（COL-I）ELISA 檢測(cè)試劑盒（南京博研生物，批號(hào)20230519）。

 

儀器：Herocell 180 二氧化碳培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司），CKX53 倒置熒光顯微鏡，（日本奧林巴斯有限公司），THZ-D 恒溫?fù)u床（杭州米歐儀器有限公司）， AB204STHZ-D 電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司），LC-36 臺(tái)式低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器），VeritiPro PCR 逆轉(zhuǎn)錄儀（賽默飛世爾科技公司），ABIQS5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（賽默飛世爾科技公司），SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)（山東博科有限公司）， 1260 高效液相（HPLC）色譜儀（美國安捷倫公司），-80℃冰箱（海爾DW86L486）。

 

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

 

1.2.1 超低分子鐵皮石斛多糖制備

 

將鐵皮石斛洗凈，60℃烘干后機(jī)械粉碎。加入超純水，投入鐵皮石斛粉末，投料質(zhì)量比為1 ∶40。加入纖維素酶在60℃下攪拌1h，隨后升溫至90℃攪拌3h。加入果膠酶，50℃攪拌1h。升溫90℃加熱30min，隨后降溫至40℃，靜置過夜。2.5μl濾膜過濾得到超低分子鐵皮石斛多糖。

 

1.2.2 超低分子鐵皮石斛多糖分子量和多糖組成

 

將石斛多糖樣品溶于0.2mol/L NaCl，配制終濃度為2mg/ml。用1ml 的注射器抽起過濾，隨后在HPLC 中進(jìn)樣。流動(dòng)相為0.2mol/L NaCl，層析溫度為40℃，流速為0.6ml/min，以右旋糖酐為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行石斛多糖分子量分析測(cè)定。將水解后的石斛多糖進(jìn)樣于凝膠層析柱進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)其保留時(shí)間值確定多糖組成。

 

1.2.3 超低分子鐵皮石斛多糖-體外功效評(píng)價(jià)

 

1.2.3.1 細(xì)胞接種

 

超低分子鐵皮石斛多糖使用無菌PBS 梯度稀釋，分別配置成1%、0.5%、0.1%的超低分子鐵皮石斛多糖稀釋液（v/v），EGF 使用無菌PBS 配置成10ng/ml 的溶液備用。

 

取對(duì)數(shù)期生長的HSF 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，待生長至密度超過80%用胰酶消化收集計(jì)數(shù)。使用完全培養(yǎng)基（90% H-DMEM+9% FBS+1% PS）（v/v）將細(xì)胞懸液進(jìn)行稀釋，按照細(xì)胞數(shù)1.0 ×105 /孔接種于6 孔板中。置于37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6~12h，使細(xì)胞正常鋪展。隨后棄去完全培養(yǎng)基，分為空白組、陽性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，分別加入對(duì)應(yīng)的條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h 后分別收集細(xì)胞和上清液?？瞻捉M：完全培養(yǎng)基（2ml）。陽性對(duì)照組：EGF（1ml）+完全培養(yǎng)基（1ml）。實(shí)驗(yàn)組：超低分子鐵皮石斛多糖使用完全培養(yǎng)基。各組分別加入1%、0.5%、0.1%（v/v）濃度的低分子鐵皮石斛稀釋液。

 

1.2.3.2 透明質(zhì)酸表達(dá)測(cè)定

 

收集細(xì)胞上清液，分別用對(duì)應(yīng)的ELISA 試劑盒，根據(jù)說明書用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中HA 表達(dá)水平。用純化的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白（HABP）包被微孔板，制成固相抗體，向包被單抗的微孔中依次加入HA、生物素化的抗大鼠透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白（HABP）、辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物3, 3′, 5, 5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色， 并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的透明質(zhì)酸含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

 

1.2.3.3 水通道蛋白3（AQP-3）和I 型膠原（COL-I）、III型膠原（COL-III）mRNA 表達(dá)測(cè)定

 

收集培養(yǎng)后的細(xì)胞，按照RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。在離心管中加入300μl 裂解液（buffer RL ∶DTT =5ml ∶100μl），連續(xù)吹打使細(xì)胞充分裂解， 加入到過濾柱中， 12000 ×g 離心1min。棄去過濾柱，在收集管中加入330μl 70%乙醇溶液，8000 ×g 離心1min，棄去收集管。將過濾柱套入新收集管，加入600μl RNA 裂解液1，8000 ×g 離心1min。棄去收集管內(nèi)液體， 加入600μl RNA 裂解液2，8000 ×g 離心1min。棄去液體，空柱在13000 ×g 離心3min。將過濾柱套入無菌無酶離心管中，在過濾柱中心加入15μl 無酶水，靜置1min，10000 ×g 離心1min，棄去過濾柱。

 

按照試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)樣品RNA 含量加入對(duì)應(yīng)的焦碳酸二乙酯（DEPC）水和樣品量。放入PCR 儀中逆轉(zhuǎn)錄。運(yùn)行結(jié)束后得到cDNA，放入-80℃冰箱保存。

 

將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 用無酶水稀釋10 倍，根據(jù)熒光PCR 試劑盒操作說明， 分別測(cè)試AQP-3、COL-I 和COL-III 的表達(dá)情況，引物詳見表1。

 

1.2.4 超低分子鐵皮石斛多糖和市售鐵皮石斛提取物對(duì)比

 

1.2.4.1 I 型膠原、III 型膠原的mRNA 表達(dá)測(cè)定

 

參照1.2.3.3 測(cè)試方案，檢測(cè)超低分子鐵皮石斛多糖[1%（v/v）]、市售鐵皮石斛提取物[1%（v/v）]在HSF 細(xì)胞中I 型膠原、III 型膠原的表達(dá)情況。

 

1.2.4.2 水通道蛋白3（AQP-3） mRNA 表達(dá)測(cè)定

 

參照1.2.2.3 測(cè)試方案，對(duì)5%（v/v）的超低分子鐵皮石斛多糖、5%（v/ v）市售鐵皮石斛提取物進(jìn)行水通道蛋白3（AQP-3）mRNA 表達(dá)測(cè)試。

 

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

 

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0 中的one-way ANOVA 方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)差異分析，結(jié)果以Mean ± SD 的方式表示，其中 p＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p越小，差異性越明顯。

 

2、結(jié)果與討論

 

常規(guī)的石斛多糖為大分子物質(zhì)，過高的分子量可能會(huì)使其在針對(duì)皮膚使用的過程中無法有效到達(dá)作用位點(diǎn)。本研究選擇了酶解的方式，在保證石斛多糖活性的前提下，降低其分子量。針對(duì)石斛多糖的單糖組成，篩選了一個(gè)雙酶體系，石斛多糖通過該體系進(jìn)行酶解，能有效的提高活性并且降低分子量。經(jīng)檢測(cè)，其平均分子量為3.66kDa，詳見表2。此外，在石斛多糖酶解后，其主要成分為D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖，這對(duì)保濕和抗皺是有利的。

皮膚真皮層的主要細(xì)胞——成纖維細(xì)胞與其分泌的膠原纖維、彈力纖維及基質(zhì)成分共同構(gòu)成了真皮的主體，因此成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性的改變，是皺紋形成的根本原因[14]。膠原纖維是皮膚中主要的結(jié)構(gòu)蛋白，也是含量最豐富的蛋白質(zhì)，對(duì)皮膚的彈性和順應(yīng)性起著重要的作用。透明質(zhì)酸是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種氨基聚糖， 具有超強(qiáng)的吸水能力，可以吸取自身體積1000 倍的水分，形成一種有彈性的黏性基質(zhì)填充在組織的空隙內(nèi)，是維持皮膚組織穩(wěn)定和彈性的重要細(xì)胞外基質(zhì)[15]。水通道蛋白3（AQP-3）是細(xì)胞膜上的一種物質(zhì)，負(fù)責(zé)水、甘油及尿素等物質(zhì)的運(yùn)輸，屬于一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白因子，主要表達(dá)于角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞。AQP-3 不僅參與皮膚水合、屏障功能， 同時(shí)在皮膚損傷和修復(fù)、愈合方面，均發(fā)揮著重要的作用，是皮膚正常形態(tài)和功能維持的重要保障[16]。已有大量研究采用體外檢測(cè)手段來評(píng)價(jià)化妝品原料是否具有相應(yīng)的功效[17-18]。本實(shí)驗(yàn)通過添加不同濃度的超低分子鐵皮石斛多糖，檢測(cè)成纖維細(xì)胞透明質(zhì)酸、膠原蛋白和AQP-3 的含量來驗(yàn)證超低分子鐵皮石斛多糖對(duì)于成纖維細(xì)胞的抗皺功效。

 

2.2 超低分子鐵皮石斛多糖的作用

 

2.2.1 在HSF 細(xì)胞系中對(duì)透明質(zhì)酸生成的影響

 

HA 在維持細(xì)胞外基質(zhì)、保濕、調(diào)節(jié)滲透壓方面發(fā)揮重要作用。而一旦皮膚中的HA 含量減少，則皮膚的保濕功能減弱， 皮膚會(huì)變得粗糙并產(chǎn)生皺紋。另外HA 還具有抗炎作用，當(dāng)炎癥因子被抑制后，多種彈性金屬蛋白酶下調(diào)，這也有助于HA 發(fā)揮抗炎作用[19-20]。游離的HA 減少，皮膚的水和能力下降，會(huì)導(dǎo)致皮膚組織細(xì)胞皺縮、老化，出現(xiàn)皮膚組織形態(tài)學(xué)改變。1%濃度的超低分子鐵皮石斛稀釋液實(shí)驗(yàn)組較陽性對(duì)照組對(duì)HA 的含量具有明顯提升（p＜0.05），而濃度為0.5%和0.1%的實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比沒有差異性， 見圖1。這表明1%的低分子鐵皮石斛多糖可以有效的提高HA 的表達(dá)水平含量，通過HA 實(shí)現(xiàn)改善皮膚保水量，從而間接促進(jìn)角質(zhì)層的修復(fù)。

 

 

2.2.2 在HSF 細(xì)胞系中對(duì)I 型膠原生成的影響

 

研究表明，膠原蛋白含量變化是影響皮膚結(jié)構(gòu)狀態(tài)的關(guān)鍵因素[21]，皮膚老化會(huì)導(dǎo)致I 型膠原蛋白（COL-I）和III 型膠原蛋白（COL-III）減少，其發(fā)生機(jī)制涉及到膠原蛋白合成與分解。超低分子鐵皮石斛多糖能夠促進(jìn)細(xì)胞的新陳代謝，加快皮膚細(xì)胞核酸和蛋白質(zhì)的合成，刺激皮膚成纖維細(xì)胞的活性，促進(jìn)膠原蛋白合成，降低皮膚成纖維細(xì)胞凋亡率，從而延緩皮膚衰老和皺紋的發(fā)生。其中濃度為1%的超低分子鐵皮石斛多糖對(duì)于COL-I 生成具有較好的促進(jìn)作用， 且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05），而0.5% 和0.1% 與空白對(duì)照組相比沒有差異性，見圖2。

 

 

2.2.3 在HSF 細(xì)胞系中對(duì)AQP-3 生成的影響

 

已有大量的實(shí)驗(yàn)研究表明導(dǎo)致皺紋的產(chǎn)生原因之一是皮膚水分流失[22-23]，造成皮膚干燥，從而對(duì)皮膚產(chǎn)生不可逆的損傷。水從基底組織擴(kuò)散到角質(zhì)層，并誘導(dǎo)角質(zhì)層的進(jìn)一步水合作用，在這個(gè)過程中，皮膚水分不斷滲透進(jìn)入基底層。AQP-3 是維持皮膚水合作用的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與細(xì)胞物質(zhì)的吸收和分泌，有助于維持彈性和修復(fù)損傷[24]。1%的實(shí)驗(yàn)組相較于空白對(duì)照組AQP-3 的mRNA 水平明顯降低（p＜0.05），見圖3。超低分子鐵皮石斛多糖具有大量能與水分子結(jié)合的羥基和羧基等極性基團(tuán)，從而使其具有吸水性。同時(shí)超低分子鐵皮石斛多糖能夠打開皮膚的水合通道，促進(jìn)水分子在皮膚的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而改善皮膚含水量，提升保濕功能減少皺紋產(chǎn)生。

 

 

 

2.3 超低分子鐵皮石斛多糖與市售鐵皮石斛提取物的對(duì)比

 

2.3.1 I 型膠原、III 型膠原mRNA 表達(dá)比較

 

超低分子鐵皮石斛多糖能夠促進(jìn)細(xì)胞的新陳代謝，刺激皮膚成纖維細(xì)胞的活性，加快皮膚表皮和真皮細(xì)胞中DNA 的合成與轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)膠原蛋白合成，抵抗外界刺激誘導(dǎo)的凋亡，從而延緩皮膚衰老和皺紋的發(fā)生。當(dāng)濃度為1%時(shí)，超低分子鐵皮石斛多糖對(duì)于COL-I、COL-III 生成具有明顯的促進(jìn)作用（p＜0.05），同時(shí)，其促進(jìn)COL-I、COL-III 的作用顯著優(yōu)于同等檢測(cè)條件下的市售鐵皮石斛提取物，具有顯著性差異（p＜0.05），見圖4 和圖5。

 

2.3.2 AQP-3 mRNA 表達(dá)比較

 

超低分子鐵皮石斛多糖在濃度1%時(shí)，可顯著上調(diào)AQP-3 的基因表達(dá)（p＜0.001），且與市售鐵皮石斛提取物相比，在相同濃度下，超低分子鐵皮石斛多糖上調(diào)AQP-3 mRNA 表達(dá)的效果更好，表明超低分子鐵皮石斛多糖在體外具有更優(yōu)的保濕作用，見圖6。

 

 

 

 

3、結(jié)    論

 

皮膚老化與表皮角質(zhì)層屏障功能的喪失和水分含量減少有關(guān)，修復(fù)角質(zhì)層屏障和保持皮膚高水合作用是改善光老化的重要因素，維持表皮角質(zhì)層的最佳水合作用水平很大程度上取決于角質(zhì)化包膜的成分和天然保濕因子。膠原蛋白是維持皮膚飽滿充盈的物質(zhì)基礎(chǔ)，I 型膠原約占皮膚膠原成分80%。同時(shí)，AQP-3 和HA 又是維持皮膚角質(zhì)層水合的重要因素。因此為了研究超低分子鐵皮石斛多糖是否能保護(hù)HSF 細(xì)胞起到皮膚屏障功能，從而在表觀上減少皺紋的產(chǎn)生，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)和ELISA 技術(shù)測(cè)定了上述相關(guān)標(biāo)志物。通過研究發(fā)現(xiàn)，超低分子鐵皮石斛多糖可以提高HA 和COL-I 的表達(dá)，并且恢復(fù)AQP-3 的轉(zhuǎn)錄水平。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，超低分子鐵皮石斛多糖改善皮膚角質(zhì)屏障和皮膚水分的最低起效濃度為1%，說明超低分子鐵皮石斛多糖可能通過改善皮膚屏障和增加皮膚水分從而減少皮膚皺紋。對(duì)比市售鐵皮石斛提取物，在1%檢測(cè)濃度下，超低分子鐵皮石斛多糖具有更好的促進(jìn)膠原蛋白基因表達(dá)及上調(diào)AQP-3 基因的能力，表明超低分子鐵皮石斛多糖在抗皺功效上優(yōu)于市售鐵皮石斛提取物。

 

目前市面上抗皺日化用品和功效型化妝品的效果不理想， 超低分子鐵皮石斛多糖以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在體外層面呈現(xiàn)了顯著的抗皺效果，為抗皺研究提供了新思路。