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免疫原性是大部分生物藥物（疫苗除外）都不愿意碰到的風險因素。免疫原性最初引起人們注意是源自重組人促紅細胞生成素的悲劇，很多患者用藥后出現(xiàn)了再生障礙性貧血。目前常用的免疫原性檢測范式是篩選、確認和表征（滴度檢測）三級檢測。篩選的目的是去除陰性樣本，畢竟不太可能對所有樣本開展滴度檢測。但篩選也保留了一定的假陽性率。所以，確認這一步目的就是去除假陽性樣本。最后一步是對確認陽性的樣本進行滴度檢測。

多國藥品監(jiān)管機構(gòu)均出臺過免疫原性相關(guān)指導(dǎo)原則，F(xiàn)DA 2019年出臺的《Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products-Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. Guidance for Industry》，EMA 2017年出臺的《Guideline on Immunogenicity Assessment of Therapeutic Proteins》，NMPA 2021年出臺的《藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，PMDA 2024年出臺的《Guidelines for Immunogenicity Assessment of Biopharmaceuticals》草案。指導(dǎo)原則雖然是免疫原性研究的重要參考文件，但指南的變更通常需要時間，有些也滯后于工業(yè)界、臨床或者患者出現(xiàn)的最新情況。最近幾年，工業(yè)界對于免疫原性研究提出了諸多疑問，比如三級檢測范式是否依然適用？采用信噪比（signal to noise）替代滴度檢測是否可行？而且，隨著新型生物制品的不斷出現(xiàn)，傳統(tǒng)檢測范式的應(yīng)用也有諸多需要討論之處。

帶著這些疑問，歐洲生物分析論壇（European Bioanalysis Forum, EBF）2023年在西班牙組織了一次主題為“Challenging the Current Paradigm for ADA testing”的討論，略作分享。

首先看下篩選、確認和滴度三級檢測范式是怎么來的。逐級檢測其實最早是參考疫苗類產(chǎn)品。不過疫苗的目的就是利用滴度表征免疫反應(yīng)，如抗體產(chǎn)生，而且疫苗通常產(chǎn)生的是比較強的免疫反應(yīng)。反觀傳統(tǒng)治療性生物制品，是不需要產(chǎn)生，也不希望產(chǎn)生非預(yù)期免疫反應(yīng)的。這點與疫苗截然相反。所以，EBF認為采用疫苗的免疫原性檢測策略對其他類型生物制品進行表征，是存在先天缺陷的。EBF建議免疫原性應(yīng)該按照biomarkers的思路進行表征。Biomarkers的定義是“A defined characteristic that is measured as an indicator of normal biological processes, pathogenic processes, or biological responses to exposure or intervention, including therapeutic interventions”。其實，免疫原性也可算作藥物暴露或者干預(yù)后，出現(xiàn)的生物學反應(yīng)。如果這一思路成立，那現(xiàn)有的免疫原性三級檢測范式及閾值的使用，可能就會受到挑戰(zhàn)。畢竟，沒太見過采用三級檢測范式表征biomarkers的情況。

三級檢測范式

典型的免疫原性三級檢測步驟如下圖所示，先對樣本進行第一級的篩選，之后對篩選陽性的樣本加樣確認，最后對確認陽性的樣本進行滴度檢測和中和活性確認。實際工作中，并不是對所有階段的臨床樣本均進行完整的三級檢測。比如，中和活性檢測通常在關(guān)鍵三期臨床才開展。

目前三級檢測范式的其中一個缺點是“過于保守”，篩選階段和確認階段分別有5%和1%的假陽性率（false positive rate），以最大程度覆蓋ADA陽性的樣本。另外，篩選和確認階段采用的檢測原理通常是一樣的，常見的是用包被的樣品捕獲，標記的樣品檢測，惟一的區(qū)別是后者額外加入了樣品進行競爭。帶來的實際效果是，確認階段幾乎很少大幅度降低篩選階段的陽性樣本。篩掉的基本都是篩選階段信號值在cut point附近的樣本。直接后果是本來ADA真陽性的樣本可能被誤殺，假陽性的樣本則污染了最終結(jié)果。Kudiak等人做過研究，發(fā)現(xiàn)移除確認階段，直接把篩選階段的假陽性率設(shè)置成1%，效果與目前篩選5%+確認1%是一樣的。另外，滴度檢測實際上就是把所謂的陽性樣本，通過多級稀釋，直至cut point值或以下，以半定量形式評估ADA陽性的程度。但滴度檢測所用的format與篩選和確認還是一樣的。這就相當于，同一個樣本，被同一種檢測方案，“折騰”了3次。

EBF圓桌會議討論認為是否包括確認階段應(yīng)該基于分子的風險而定，而不是一種機械操作，即所有分子均包含確認測試。如果排除確認步驟，篩選步驟的假陽性率應(yīng)調(diào)整為1%，而不是5%?？梢栽谠缙谂R床ADA樣本檢測時，包含確認步驟，同時伴隨1%假陽性的篩選，以判斷將確認步驟剔除是否有影響。

信噪比（signal/noise, S/N）替代滴度檢測

EBF認為S/N途徑已經(jīng)有大量數(shù)據(jù)和公開文獻支持。建議向監(jiān)管機構(gòu)提交免疫原性檢測策略時，企業(yè)可以將S/N作為一種方案，與監(jiān)管機構(gòu)進行討論。EBF認為S/N>x，可以替代現(xiàn)有的滴度>y，同樣能說明機體對于藥物是否出現(xiàn)臨床意義的反應(yīng)。另外，抗藥抗體一般都非常穩(wěn)定，可以將樣本保留，如果監(jiān)管機構(gòu)提出異議，再行滴度檢測。

表征測試

很多生物藥物具備雙靶點、三靶點特異性，或者融合、偶聯(lián)了其它分子。很多公司對這類產(chǎn)品免疫反應(yīng)表征時想研究清楚到底是分子的哪個部分產(chǎn)生的免疫原性風險。當然，這并不是來自監(jiān)管機構(gòu)的考量，更多是出于企業(yè)內(nèi)部決策，為后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)或者平臺優(yōu)化提供依據(jù)。另外一點是關(guān)于中和活性的表征。除非是高風險分子，企業(yè)通常會將中和活性檢測放在3期關(guān)鍵臨床階段開展。FDA回溯2019年1月-2022年12月批準上市的生物制品，5.4%用滴度+PK/PD數(shù)據(jù)替代中和活性檢測，21.7%未開展任何中和抗體檢測。

EBF認為是否開展額外的表征，需要基于產(chǎn)品風險而定。如果要開展，由于這類表征方法的復(fù)雜性，需要盡早開始對關(guān)鍵試劑的開發(fā)和表征。

單孔分析

其實單孔分析在PK檢測中比較多見，ICH M10《生物分析方法驗證及樣品分析》中也有相關(guān)描述。不過，雖然監(jiān)管機構(gòu)指南中未做要求，但免疫原性檢測中還是以復(fù)孔為主。免疫原性檢測一般采用bridging assay format，其中一步是將標記的試劑與樣本或陽性對照進行孵育，孵育采用單孔，后續(xù)從該單孔中吸取樣本加入到兩個復(fù)孔之中。從科學性角度，這種操作除了測試加樣手法，并無價值，也失去復(fù)孔檢測精密度的意義。

EBF認為免疫原性單孔分析可以接受，監(jiān)管并無復(fù)孔要求。而且，單孔對樣本量要求更低，更加符合患者為中心的思想。需要的樣本儲存空間、微孔板、試劑量也大大減少。

藥物耐受性

研究樣本中通常含有一定濃度的受試藥物，可能會對免疫原性檢測造成影響，比如假陰性的出現(xiàn)。因此，方法開發(fā)過程中要注意方法能否耐受高濃度藥物。EMA免疫原性指導(dǎo)原則中提到，免疫原性方法的藥物耐受水平要超過待測樣本中的藥物濃度。當然，EMA也承認有時可能會遇到技術(shù)困難，所以也強調(diào)盡可能開發(fā)最佳測試方法。

還有一點需要注意。ADA藥物耐受性驗證是采用陽性對照樣本完成的。眾所周知，ADA陽性對照與體內(nèi)真實樣本中的抗藥抗體并不相同，所以方法驗證中的藥物耐受水平僅是一個估計值。

EBF認為如果可能，取樣時間點盡可能仔細選擇，比如血藥濃度較低時間點的樣本。另外，選擇藥物耐受性的藥物濃度時，也需要結(jié)合臨床研究進行設(shè)計?？梢圆捎?00ng/mL濃度的陽性對照進行藥物耐受性方法開發(fā)，如果100ng/mL有困難，可以考慮采用250、500ng/mL。對于低免疫原性風險的分子，僅在篩選階段進行藥物耐受驗證即可。對于風險較高的分子，可以在篩選、確認階段均進行。通常不在滴度檢測中開展藥物耐受驗證。另外，藥物耐受驗證通常僅開展1個驗證批就可以。最后，EBF建議如果藥物耐受水平達不到，盡早與監(jiān)管機構(gòu)進行溝通。

安慰劑組ADA樣本檢測

在臨床PK研究中，通常不對安慰劑組患者采樣，也不用額外做出解釋。但是，免疫原性研究中，有些公司會對安慰劑同樣檢測，增加了成本，浪費了時間，實際并無太大價值。當然，產(chǎn)生這種狀況也有些客觀原因，比如中心實驗室并未揭盲，不知道哪些樣本來自安慰劑組?；蛘咄ㄟ^隨機碼確認哪些樣本不包含藥物有一定挑戰(zhàn)。也可能就是想確認下開發(fā)的ADA方法是否符合預(yù)期，畢竟安慰劑組大多ADA陰性。

EBF則建議除非有正當合理的理由，安慰劑樣本無需檢測。即使檢測，僅在早期研究中挑個別時間點即可。

最后

EBF其實發(fā)布了很多免疫原性相關(guān)的文章。傳統(tǒng)的三級檢測范式已經(jīng)用了很多年，同一個樣本，采用同一種檢測format測3遍，且很多時候，確認較篩選額外貢獻的價值有限。故，EBF提出的采用篩選階段的S/N，不再進行確認和滴度檢測，也不設(shè)置cut point，將所有S/N數(shù)據(jù)繪制并呈現(xiàn)出來。這樣，所有患者的ADA產(chǎn)生情況僅以1個S/N數(shù)據(jù)判定。如果這個思路能行得通，那整個檢測效率、成本、數(shù)據(jù)解讀等不是現(xiàn)有的三級檢測模式可比的。最后，ADA并不是孤立的，單獨的ADA并未太大意義，ADA最終還是要與PK、PD或毒性進行關(guān)聯(lián)分析。當然，這篇文章僅代表AstraZeneca、Merck KgaA、Pfizer、Sanofi、Charles River、Labcorp、Roche等工業(yè)界的觀點，不確定FDA或者EMA是否有類似先例成功申報并獲批。