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導(dǎo)讀

 

在生物制藥領(lǐng)域，重組蛋白的生產(chǎn)是一項(xiàng)至關(guān)重要的技術(shù)，而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)因其諸多優(yōu)勢，如生長迅速、易于培養(yǎng)、遺傳背景清晰等，成為了生產(chǎn)重組蛋白的常用選擇。然而，要在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效、高質(zhì)量的重組蛋白表達(dá)，并非一帆風(fēng)順，而是面臨著諸多挑戰(zhàn)。今天，讓我們一起解讀發(fā)表于International Journal of Biological Macromolecules（IF:7.7）的文章“Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements”，探討實(shí)現(xiàn)天然重組蛋白產(chǎn)量最大化的策略。

 

圖1 在大腸桿菌中目的基因異源表達(dá)的示意圖

 

一、大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的基礎(chǔ)要素

 

重組蛋白的表達(dá)依賴于表達(dá)載體和宿主的協(xié)同作用。表達(dá)載體是實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的關(guān)鍵工具，其包含多個重要元件（圖2）。其中，啟動子尤為關(guān)鍵，它如同基因表達(dá)的“開關(guān)”，控制著轉(zhuǎn)錄的起始。理想的啟動子應(yīng)具備強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄活性，以確保目的蛋白的高效積累，同時還需具備嚴(yán)格的調(diào)控能力，防止產(chǎn)物毒性對宿主細(xì)胞造成損害。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中啟動子的種類繁多（如lac、tac、trc），每種啟動子都有其獨(dú)特的性能，可以根據(jù)蛋白的性質(zhì)和需求進(jìn)行選擇。同時，為了提高蛋白表達(dá)水平，一些研究對啟動子進(jìn)行了優(yōu)化，如通過對lacUV5啟動子進(jìn)行突變，或調(diào)節(jié)T7 RNA聚合酶的活性，來優(yōu)化膜蛋白基因的轉(zhuǎn)錄[1]。在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)蛋白的具體情況，選擇合適的啟動子優(yōu)化策略，以達(dá)到最佳表達(dá)效果。

 

圖2 大腸桿菌表達(dá)載體的關(guān)鍵部分

 

宿主菌株的選擇對于重組蛋白的成功表達(dá)至關(guān)重要，需根據(jù)表達(dá)載體的特性進(jìn)行適配。此外，針對一些特殊蛋白，如膜蛋白、含有稀有密碼子的蛋白或?qū)?xì)胞有毒性的蛋白，還需選用經(jīng)過特殊改造的宿主菌株，這些菌株通過優(yōu)化自身的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制或蛋白質(zhì)折疊環(huán)境，能夠更好地適應(yīng)這些難表達(dá)蛋白的生產(chǎn)需求。例如，Rosetta菌株攜帶了識別稀有密碼子的tRNA基因，可有效解決因密碼子偏好導(dǎo)致的表達(dá)問題；Origami、Origami B、Rosetta-gami和SHuffle等菌株則通過突變關(guān)鍵基因，增強(qiáng)了胞內(nèi)二硫鍵的形成能力，有利于含有二硫鍵的蛋白正確折疊[2]。

 

二、影響重組蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素

 

2.1蛋白特性的影響

 

蛋白的大小對其在大腸桿菌中的表達(dá)有著顯著影響，小于100kDa的蛋白通常較易表達(dá)，而大于100kDa的蛋白則可能面臨表達(dá)困難，甚至被降解或提前終止翻譯的問題，且小蛋白（<10kDa）也可能因折疊不當(dāng)和易受蛋白酶降解而難以穩(wěn)定表達(dá)。不同生物對密碼子的使用存在偏好可能導(dǎo)致重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時出現(xiàn)問題，當(dāng)mRNA中的密碼子不被宿主細(xì)胞的tRNA識別時，會出現(xiàn)翻譯停滯、提前終止、移碼或氨基酸錯誤摻入等情況，從而降低蛋白表達(dá)的數(shù)量和質(zhì)量。

 

2.2 蛋白毒性的挑戰(zhàn)

 

部分重組蛋白對宿主細(xì)胞具有毒性，這會嚴(yán)重阻礙其表達(dá)。這些毒性蛋白可能干擾宿主細(xì)胞的正常生理功能，如破壞細(xì)胞膜完整性、影響代謝途徑或引發(fā)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞生長受限甚至死亡。因此，在表達(dá)這類蛋白時，必須采取特殊策略，如使用嚴(yán)格調(diào)控的表達(dá)載體。

 

2.3膜蛋白表達(dá)的難點(diǎn)

 

由于膜蛋白通常具有跨膜結(jié)構(gòu)域，其在細(xì)胞內(nèi)的過量表達(dá)容易使Sec轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)飽和，導(dǎo)致蛋白無法正確插入細(xì)胞膜，進(jìn)而在細(xì)胞質(zhì)中聚集形成包涵體。此外，膜蛋白的疏水性使其易于相互作用并聚集，進(jìn)一步加劇了表達(dá)和折疊的困難。為克服這些問題，研究人員嘗試通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平來控制膜蛋白基因的表達(dá)速度，減少蛋白聚集的發(fā)生。

 

2.4蛋白翻譯后修飾的需求

 

許多真核來源的蛋白質(zhì)需要特定的翻譯后修飾才能具備生物學(xué)活性，如二硫鍵形成、糖基化等。然而，大腸桿菌作為原核生物，其細(xì)胞質(zhì)環(huán)境呈還原性，不利于二硫鍵的形成，這會導(dǎo)致含有二硫鍵的蛋白無法正確折疊，從而失去活性。對于一些需要復(fù)雜糖基化修飾的蛋白，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)則無法滿足其修飾需求，此時則需選擇真核表達(dá)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)蛋白的正確修飾和功能表達(dá)。

 

三、重組蛋白表達(dá)的優(yōu)化策略

 

3.1誘導(dǎo)條件的精細(xì)調(diào)控

 

誘導(dǎo)劑的濃度對蛋白表達(dá)至關(guān)重要，濃度過低會導(dǎo)致誘導(dǎo)效率低下，蛋白表達(dá)量不足；而濃度過高則可能產(chǎn)生毒性，抑制細(xì)胞生長，同時使蛋白合成速度超過折疊能力，導(dǎo)致包涵體形成。因此，針對不同蛋白，需精確優(yōu)化誘導(dǎo)劑濃度，以實(shí)現(xiàn)高效可溶性表達(dá)。此外，溫度對蛋白表達(dá)影響也很顯著，較低溫度通常有助于減少蛋白聚集，提高可溶性蛋白的比例，因?yàn)榈蜏乜山档褪杷嗷プ饔?，抑制蛋白聚集反?yīng)。然而，對于某些蛋白，高溫或熱休克處理在誘導(dǎo)前進(jìn)行，可通過激活熱休克蛋白等機(jī)制，提高蛋白的溶解度，避免其進(jìn)入包涵體。誘導(dǎo)時的細(xì)菌生長階段也會影響蛋白表達(dá)，在早對數(shù)生長期誘導(dǎo)，通?？色@得較高的蛋白產(chǎn)量和活性，同時降低內(nèi)源性蛋白的干擾，有利于蛋白純化。但在某些情況下，晚對數(shù)期或穩(wěn)定期誘導(dǎo)可能對特定蛋白的表達(dá)更為有利，如對于對宿主細(xì)胞有毒性的蛋白。

 

3.2培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

 

由于大腸桿菌的二階段生長特性，葡萄糖的存在會抑制乳糖操縱子的表達(dá)，即所謂的“代謝物阻遏”現(xiàn)象。在誘導(dǎo)前添加適量葡萄糖可有效抑制基礎(chǔ)表達(dá)，減少毒性蛋白對細(xì)胞的損害。同時，合理控制葡萄糖濃度還能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和重組蛋白表達(dá)，避免葡萄糖過量導(dǎo)致的細(xì)胞生長抑制和蛋白表達(dá)下降。此外，如表1所示，向培養(yǎng)基中添加特定添加劑可改善蛋白折疊和穩(wěn)定性，從而提高可溶性蛋白的產(chǎn)量[3]。

 

表1 添加劑及其可能的作用

 

3.3融合標(biāo)簽的應(yīng)用策略

 

融合標(biāo)簽是提高蛋白可溶性表達(dá)和簡化純化過程的有效手段。例如，麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、硫氧還蛋白等標(biāo)簽（表2），它們不僅能促進(jìn)蛋白正確折疊，還可通過親和層析實(shí)現(xiàn)一步純化。為將重組蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)空間或分泌到培養(yǎng)基中，可使用特定信號序列或融合標(biāo)簽，如PelB、OmpA、PhoA等信號序列可引導(dǎo)蛋白通過內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)空間，利用周質(zhì)空間的氧化環(huán)境促進(jìn)二硫鍵形成，提高蛋白穩(wěn)定性和活性[4]。

 

表2 用于可溶性蛋白表達(dá)的各種融合標(biāo)簽

 

3.4分子伴侶共表達(dá)的協(xié)同作用

 

分子伴侶在蛋白折疊過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們能夠協(xié)助新生多肽鏈正確折疊，防止其聚集形成非功能性結(jié)構(gòu)。在大腸桿菌中，共表達(dá)分子伴侶如GroEL/GroES或DnaK/DnaJ/GrpE系統(tǒng)，可顯著提高某些難表達(dá)蛋白的可溶性和活性[5]。然而，不同蛋白可能需要特定的分子伴侶協(xié)助，因此準(zhǔn)確識別并共表達(dá)與之匹配的分子伴侶至關(guān)重要。通過優(yōu)化分子伴侶的共表達(dá)策略，可有效改善蛋白折疊環(huán)境，提高蛋白表達(dá)質(zhì)量。

 

結(jié)語

 

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在重組蛋白表達(dá)中具有重要地位，但面臨諸多挑戰(zhàn)。通過深入理解影響蛋白表達(dá)的各種因素，并針對性地運(yùn)用優(yōu)化策略，如精細(xì)調(diào)控誘導(dǎo)條件、優(yōu)化培養(yǎng)基成分、合理應(yīng)用融合標(biāo)簽、共表達(dá)分子伴侶以及有效處理包涵體等，能夠顯著提高重組蛋白的表達(dá)水平和質(zhì)量。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，相信未來會有更多創(chuàng)新策略涌現(xiàn)，進(jìn)一步推動大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在生物制藥、工業(yè)酶生產(chǎn)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，為生命科學(xué)研究和人類健康事業(yè)做出更大貢獻(xiàn)。

 

參考文獻(xiàn)

 

[1] Wagner S, Klepsch MM, Schlegel S, Appel A, Draheim R, Tarry M, Högbom M, van Wijk KJ, Slotboom DJ, Persson JO, de Gier JW. Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008, 105(38):14371-14376.

 

[2] Lobstein J, Emrich CA, Jeans C, Faulkner M, Riggs P, Berkmen M. SHuffle, a novel Escherichia coli protein expression strain capable of correctly folding disulfide bonded proteins in its cytoplasm. Microb Cell Fact. 2012, 11(1):753.

 

[3] Patil G, Rudolph R, Lange C. In vitro-refolding of a single-chain Fv fragment in the presence of heteroaromatic thiols. J Biotechnol. 2008, 134(3):218-221.

 

[4] Malik A. Protein fusion tags for efficient expression and purification of recombinant proteins in the periplasmic space of E. coli. 3 Biotech. 2016, 6(1):44.

 

[5] Voulgaridou GP, Mantso T, Chlichlia K, Panayiotidis MI, Pappa A. Efficient E. coli expression strategies for production of soluble human crystallin ALDH3A1. PLoS One. 2013, 8(2):e56582.