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膠原蛋白是細胞外基質(zhì)中重要的結(jié)構(gòu)成分，分布于所有組織和器官。它不僅賦予組織強度、耐久性和彈性，還廣泛參與各種生物過程。膠原蛋白應用廣泛，涵蓋醫(yī)療美容、功效護膚、嚴肅醫(yī)療及其他消費等領域。

肽圖檢測法

肽圖檢測法利用特定的化學試劑或酶將蛋白質(zhì)特異性降解為肽段，然后通過分離和鑒定，并與經(jīng)同一方法處理的對照品進行比較和結(jié)果判定。根據(jù)所選用的檢測儀器不同，肽圖分析可以分為基于高效液相色譜法的肽圖分析和基于質(zhì)譜法的肽圖分析。

通過與對照品肽圖的比較，可以對生產(chǎn)過程中的膠原蛋白的質(zhì)量進行評估和監(jiān)控，確保產(chǎn)品的一致性和質(zhì)量穩(wěn)定性。

基于反相高效液相色譜法的肽圖分析

反相高效液相色譜（RP-HPLC）法是一種操作簡單、檢測靈敏度高的分析方法，可提供豐富的蛋白質(zhì)和肽段信息，是蛋白質(zhì)和肽段分析與表征的標準方法。

HPLC肽圖分析通常用于常規(guī)鑒別試驗。在該分析中，肽段經(jīng)過色譜柱分離后，使用紫外檢測器在波長范圍200~230 nm（通常為214 nm）記錄色譜圖。通過將供試品溶液的色譜圖與對照品相比較，最終可以對膠原蛋白類產(chǎn)品進行肽圖鑒別。

HPLC肽圖分析的實驗步驟通常包括供試品和對照品的預處理（如溶解、變性）、膠原蛋白的特異性裂解、肽段的分離和檢測，以及結(jié)果的分析和判定。

膠原蛋白相關標準及肽圖檢測依據(jù)

以上這些標準基本都是依據(jù)《中國藥典》2020 四部 肽圖檢查法 法一或結(jié)合質(zhì)譜法進行肽圖分析的。

△《中國藥典》2020 四部 3405 肽圖檢查法 法一 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法

△《中國藥典》2020 四部 0431 質(zhì)譜法，采用適宜的質(zhì)譜技術對各色譜峰對應的肽段進行定性

1、檢測樣品

牛I型膠原蛋白凍干品

2、實驗儀器

高效液相色譜儀（紫外檢測器）

高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀

3、結(jié)果展示

牛I型膠原蛋白凍干品（供試品和對照品）酶解6 h后的樣品經(jīng)過HPLC的分離，紫外檢測器采集數(shù)據(jù)，得到肽圖結(jié)果，色譜圖如圖1。根據(jù)上述色譜圖分析結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)供試品中的主要肽段出峰時間和相對比例（響應強度）與對照品基本一致。牛I型膠原蛋白凍干品（供試品和對照品）酶解6 h后的樣品經(jīng)過HPLC的分離，紫外檢測器采集數(shù)據(jù)，得到肽圖結(jié)果，色譜圖如圖1。

經(jīng)過高分辨質(zhì)譜對肽段進行進一步分析和驗證，發(fā)現(xiàn)基本都是帶兩個或三個電荷肽段 ，如圖2和圖3所示。因此，進一步確認酶解確實生成了肽段，且供試品和對照品結(jié)果一致。

圖1 胰蛋白酶酶解6 h的肽圖

（黑色：空白對照；紅色：對照品；藍色：供試品）

圖2 胰蛋白酶酶解6 h的TIC圖

（紅色：空白對照；綠色：對照品；紫色：供試品）

圖3 提取12.6 min左右的質(zhì)譜圖

（紫色：空白對照；綠色：對照品；紅色：供試品）

膠原蛋白的肽圖分析除使用液相色譜法進行鑒別外，還可以使用 LC-MS/MS 對生成的特征多肽進行測定。以不同類型膠原蛋白特征多肽的保留時間(RT)和二級子離子碎片的質(zhì)荷比(m/z)進行定性和確證，以合成的不同類型膠原蛋白特征多肽作為對照品，用外標法或內(nèi)標法對膠原蛋白多肽進行定量，可以間接反映膠原蛋白的含量。