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導(dǎo)讀

 

近年來標(biāo)簽輔助蛋白純化是學(xué)術(shù)研究和大規(guī)模工業(yè)需求的首選方法，在蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程中應(yīng)用純化標(biāo)簽有助于節(jié)省時間和成本，但標(biāo)記融合蛋白的設(shè)計和應(yīng)用具有挑戰(zhàn)性，適當(dāng)?shù)臉?biāo)記策略必須保證最終蛋白產(chǎn)品的表達(dá)量和高純度，同時保持其天然結(jié)構(gòu)和功能。伊朗研究人員曾在Biotechnology Advances上發(fā)表了題目為《Opportunities and challenges of the tag-assisted protein purification techniques: Applications in the pharmaceutical industry》的綜述。詳細(xì)介紹了蛋白質(zhì)和肽結(jié)構(gòu)的純化標(biāo)簽的分類、選擇及在親和、離子交換、反相和固定化金屬離子親和色譜中的應(yīng)用。

 

一、蛋白純化標(biāo)簽概述

 

蛋白純化標(biāo)簽是一種在蛋白表達(dá)體系中引入特定序列或結(jié)構(gòu)的標(biāo)簽，利用這一標(biāo)簽與其它分離手段的相互作用，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)蛋白的高效純化的技術(shù)。標(biāo)簽可以是一個完整的酶，一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或一個小的多肽鏈。它們可以結(jié)合一系列底物，如碳水化合物、小生物分子、金屬螯合劑和高特異性抗體，并有助于提高相關(guān)對應(yīng)物的回收率和產(chǎn)量[1]。

 

二、蛋白質(zhì)和肽標(biāo)簽的一般分類

 

標(biāo)簽可以添加到目標(biāo)蛋白的任何一端，因此它們可以是c端特異性的或n端特異性的或c端和n端特異性的。從生物化學(xué)角度看，標(biāo)簽可分為非干擾性標(biāo)簽和干擾性標(biāo)簽。

 

2.1非干擾性標(biāo)簽

 

非干擾性標(biāo)簽如組氨酸標(biāo)簽His-tag和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（Calmodulin-Binding Peptide，CBP）等，純化后不需要去除標(biāo)簽序列，并且一些非干擾性標(biāo)簽對重組蛋白的性質(zhì)和功效有多種積極影響?？梢蕴岣呱a(chǎn)產(chǎn)量和質(zhì)量、促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊、防止蛋白水解、抑制融合蛋白的抗原性、改善功能特性及增加目標(biāo)蛋白的溶解度等。一些基于標(biāo)簽的系統(tǒng)（如熒光標(biāo)簽）還可用于跟蹤蛋白質(zhì)表達(dá)和純化過程。

 

2.2干擾性標(biāo)簽

 

干擾性標(biāo)簽如麥芽糖結(jié)合蛋白（Maltose-Binding Protein，MBP）和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-Transferase，GST）等，通常較大，會干擾主蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，所以純化后必須去除。其缺點(diǎn)包括生物活性改變、蛋白質(zhì)產(chǎn)量降低、產(chǎn)生毒性、結(jié)構(gòu)靈活性不當(dāng)、蛋白質(zhì)聚集或錯誤折疊等。有時可通過特定的蛋白酶系統(tǒng)去除標(biāo)簽，并且在設(shè)計干擾性標(biāo)簽時，需要在目標(biāo)蛋白和標(biāo)簽序列之間設(shè)置特定的蛋白酶位點(diǎn)。

 

三、蛋白純化最佳標(biāo)簽的選擇

 

為標(biāo)簽輔助純化系統(tǒng)引入最佳標(biāo)簽時應(yīng)考慮多種因素，包括易于去除、單步純化、對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響最小、多功能性和可及性等[2][3]。當(dāng)標(biāo)簽在目標(biāo)蛋白內(nèi)折疊時，這一過程可能會受阻，因此在為每個實(shí)驗選擇合適的標(biāo)簽時，同時還需考慮其他因素如蛋白質(zhì)類型、表達(dá)系統(tǒng)的性質(zhì)以及目標(biāo)蛋白的后續(xù)應(yīng)用[4]。例如His-tag純化系統(tǒng)對二氫葉酸還原酶（Dihydrofolate Reductase，DHFR）的純化比組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（Histone Acetyltransferase，HAT）更有效。

 

四、標(biāo)簽輔助色譜法純化蛋白

 

4.1標(biāo)簽輔助親和色譜法

 

親和色譜是生物技術(shù)競爭市場中最常用的工具。一組兩種生物分子（如抗原-抗體、激素-受體和酶底物）之間的選擇性和特異性相互作用是親和系統(tǒng)設(shè)計的基礎(chǔ)。在每一個親和體系中，這對分子中的任何一個都固定在固體載體（主要由瓊脂糖或二氧化硅基質(zhì)組成）上，形成親和配體，在通過色譜柱時幫助捕獲對應(yīng)的配體。最后在徹底清洗不可保留的成分后，使用合適的洗脫緩沖液從色譜柱中回收有價值的親和配體。根據(jù)參與親和相互作用的配體的性質(zhì)，親和系統(tǒng)可分為四大類：免疫親和（基于抗原抗體或表位抗體相互作用）；特定配體生物親和性（基于酶與其相應(yīng)的特定底物、抑制劑或輔助因子的相互作用，以及特定的激素受體相互作用）；一般配體生物親和性（基于某些生物分子對一組配體的一般親和性）及適配體親和層析（Aptamer Affinity Chromatography，AAC）。

 

圖1 標(biāo)簽輔助的一般配體生物親和性和特定配體生物親和性純化

 

4.2標(biāo)簽輔助固定化金屬離子親和色譜法

 

固定化金屬離子親和層析（Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC）系統(tǒng)是基于一些蛋白質(zhì)和肽序列對金屬離子的親和性。這些蛋白質(zhì)和肽序列必須包含能與金屬離子形成強(qiáng)配位共價鍵的電子供體原子（如在組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和絲氨酸中發(fā)現(xiàn)的氮、硫或氧），金屬離子使用螯合連接劑固定在色譜樹脂上，螯合連接劑可能針對某些類別的金屬離子。螯合連接劑和金屬離子都將決定色譜柱對蛋白質(zhì)和肽序列的選擇性。例如，Ni2+、Co2+和Cu2+柱更適合吸附富含組氨酸的序列，而Fe3+和Zn2+柱更適合吸附磷酸化蛋白。設(shè)計含有電子給體原子殘基的標(biāo)記序列可以促進(jìn)IMAC在蛋白質(zhì)純化中的應(yīng)用。組氨酸標(biāo)簽His-tag是最常用的標(biāo)簽之一，可用于多種蛋白質(zhì)的分離，包括重組蛋白和抗體，具有小且非干擾性等優(yōu)點(diǎn)。6個poly-His標(biāo)簽序列被認(rèn)為是最常見的融合標(biāo)簽，在60%以上的晶體學(xué)研究中作為載體驅(qū)動標(biāo)簽被廣泛使用。它還可以在免疫親和層析中用作表位標(biāo)簽。還有基于其他蛋白質(zhì)改造的具有金屬結(jié)合特性的標(biāo)簽。

 

圖2 固定化離子親和層析（IMAC）

 

4.3標(biāo)簽輔助離子交換色譜法

 

蛋白質(zhì)和多肽可能含有多種可滴定殘基，在給定的pH下，它們的電離狀態(tài)將決定它們的電荷，從而決定它們所參與的序列的凈電荷。通過調(diào)節(jié)溶液的pH值和/或離子強(qiáng)度，可以很容易地調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和肽的凈電荷，這使它們成為離子交換色譜（Ion Exchange Chromatography，IEC）柱分離的絕佳選擇。IECs中的固定相由固體樹脂組成，固體樹脂與離子交換基團(tuán)共價鍵合。這些離子交換基團(tuán)既可以是正電荷（陰離子交換劑）也可以是負(fù)電荷（陽離子交換劑）?；撬岷汪人崾顷栯x子交換劑的典型代表，叔銨和季銨陽離子是陰離子交換劑的經(jīng)典代表。根據(jù)肽和蛋白質(zhì)序列的凈電荷，在給定的pH值下，它們可以被靜電吸附到離子或陽離子交換器上，并通過IEC柱分離。與其他色譜方法相比，IEC更便宜，耐受性更強(qiáng)，但特異性較差。因此目前在不斷努力提高IEC的選擇性，特別是在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面。設(shè)計一個足夠帶電的標(biāo)簽，可以連接到目標(biāo)蛋白而不干擾其天然結(jié)構(gòu)，是基于IEC的蛋白純化方案的決定性策略。理想的標(biāo)簽序列將在其靶蛋白和離子交換劑之間提供更強(qiáng)的吸附，這意味著更有效的標(biāo)簽系統(tǒng)需要更嚴(yán)格的洗滌條件。

 

圖3 離子交換色譜示意圖

 

4.4標(biāo)簽輔助反向色譜法

 

在反向色譜（Reversed Phase Chromatography，RPC）中分子根據(jù)其疏水性和吸附在疏水固定相上的傾向進(jìn)行分離。制備RPC疏水樹脂的常用策略是將不同鏈長的碳?xì)浠衔锕潭ㄔ诠潭ㄏ嗌?，得到一系列反相吸附劑（如C4、C8或C18柱）。樣本在極性溶劑中加載，疏水組分吸附在疏水性樹脂上（熱力學(xué)有利的方式），然后用極性逐漸降低的洗脫緩沖液回收，RPC可用于分離非常相似的蛋白質(zhì)和肽。與其他色譜技術(shù)相比，RPC更具經(jīng)濟(jì)性和非破壞性。盡管在折疊過程中，大多數(shù)疏水殘基傾向于埋藏在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部，但那些留在表面的殘基將成為蛋白質(zhì)參與的許多選擇性疏水相互作用的關(guān)鍵參與者（例如膜運(yùn)輸，幾種酶活性等）。常用的標(biāo)簽包括多聚苯丙氨酸、多聚異亮氨酸和多聚酪氨酸等，其中最常見的是色氨酸基序列。一些特殊的標(biāo)簽設(shè)計如C9R是一種用于提高煙草蝕紋病毒（Tobacco Etch Virus，TEV）蛋白酶溶解性和表達(dá)產(chǎn)量的標(biāo)簽。

 

圖4 反向色譜示意圖

 

結(jié)語

 

由于生物信息學(xué)的最新進(jìn)展和高通量技術(shù)的出現(xiàn)，許多新的標(biāo)簽被引入市場，各種干擾和非干擾標(biāo)簽已經(jīng)超出了作為簡單的凈化工具的傳統(tǒng)用途，拓寬了其應(yīng)用范圍。目前在簡化蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程方面已經(jīng)取得了很大進(jìn)步，但是在設(shè)計和/或選擇適合特定應(yīng)用的標(biāo)簽時仍然需要考慮多種因素，并且在標(biāo)簽技術(shù)的成熟方面還有待取得更大進(jìn)展。

 

參考文獻(xiàn)

 

[1] Yeonju Lee, Kyung-Min Kim, et al (2023). Cyclized proteins with tags as permeable and stable cargos for delivery into cells and liposomes. International Journal of Biological Macromolecules.252.

 

[2] Kinrade, B., Davies, et al (2020). Bacterial sugar-binding protein as a one-step affinity purification tag on dextran-containing resins. Protein Expr. Purif. 168, 105564.

 

[3] Zhao, F., Song, et al (2020). Purification and immobilization of α-amylase in one step by gram-positive enhancer matrix (GEM) particles from the soluble protein and the inclusion body. Appl. Microbiol. Biotechnol. 104 (2), 643–652.

 

[4] Xinyi Wang, Xinxin Feng, et al (2023).Promoting soluble expression of hybrid mussel foot proteins by SUMO-TrxA tags for production of mussel glue.International Journal of Biological Macromolecules. 225, 840-847.