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Western Blot又稱蛋白質(zhì)免疫印跡，其原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的樣品進行著色，進而根據(jù)著色位置及著色深度判斷特定蛋白在組織或細胞中的表達情況。

 

ImageJ是一款功能強大的開源圖像處理和分析軟件，常用來分析對實驗結(jié)果進行定量分析。在wb實驗中，ImageJ可以通過蛋白表達的相對強度，進行半定量的分析。以下詳細介紹使ImageJ處理wb條帶和后續(xù)數(shù)據(jù)分析方法。

 

1、打開ImageJ，點擊File-Open ,選中目的條帶。

 

 

2、使用ImageJ打開WB圖像，并轉(zhuǎn)換為8位灰度圖像（Image——Type—— 8-bit）

 

3、去除背景陰影，Process——Subtract Backfround,在彈出的對話框中Polling ball radius 填50，并勾選Light background,再點擊OK。

 

4、設(shè)置測量參數(shù)Analyz——Set Measurements，選擇所需的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，如面積（Area）、平均灰度值（Mean gray value）、最小和最大灰度值（Min & max gray value）、積分密度（Integrated density）等 。

 

 

5、設(shè)置單位，Analyze——Set Scale，對話框填寫單位pixel。

 

 

6、轉(zhuǎn)為亮帶，Edit——Invert。

 

7、根據(jù)實際情況用矩形或圓圈選取第一個條帶，框內(nèi)或圈內(nèi)為整個條帶。

 

8、Analyze——measurement，或者使用快捷鍵Ctrl+M，即可測量出所選條帶的灰度值。同理，可測出所有條帶的灰度值，即IntDen所在列數(shù)值。

 

9、根據(jù)所測條帶的灰度值計算相對表達量，即Target protein與β-actin灰度值的比值。

 

10、打開GraphPad，選擇clumn ，點擊create，并將相對表達量錄入并命名。 

 

11、點擊Analyze，選擇t test，再點擊OK。 

 

12、使用參數(shù)非配對t test，如下圖所示。 

 

13、統(tǒng)計結(jié)果P<0.05即表示有統(tǒng)計學意義。

 

14、點擊New Graph，根據(jù)實際需求選擇作圖方式。

 

15、作圖并添加統(tǒng)計學差異標識。

            

 

常見問題：

 

1、批量操作時出現(xiàn)錯誤：確保ImageJ是最新版本，并重啟軟件。如果問題仍然存在，檢查代碼中是否有多余的“close”命令，這可能導致活躍圖片被關(guān)閉。

 

2、圖像尺寸過大：如果圖像尺寸超出了ImageJ的最大限制，嘗試分塊讀取圖像。

 

3、圖像分析結(jié)果不準確：檢查閾值設(shè)置是否正確，并確保圖像質(zhì)量足夠好，以便軟件可以正確識別感興趣的對象。

 

4、圖像無法正確導入：確保圖像格式被ImageJ支持，檢查文件路徑是否正確。

 

5、圖像無法正確保存：檢查保存格式是否正確，確保有足夠的磁盤空間。

 

6、圖像分析時出現(xiàn)彩色條紋：這可能是由于圖像數(shù)據(jù)類型不正確，轉(zhuǎn)換圖像數(shù)據(jù)類型（Image → Type）。