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DNA凝膠回收即從瓊脂糖凝膠中提取DNA的過(guò)程，大致經(jīng)過(guò)切膠、溶解、離心分離等步驟，常規(guī)回收過(guò)程一般使用試劑盒實(shí)現(xiàn)，其常見問(wèn)題及注意事項(xiàng)如下：

1.對(duì)于需要回收的DNA，跑膠時(shí)應(yīng)選擇梳齒寬、薄的梳子，同時(shí)保證上樣量充足。

2.切膠過(guò)程中，若不確定條帶具體位置，可在紫外照射下進(jìn)行，快速切膠，防止紫外照射時(shí)間過(guò)久導(dǎo)致DNA變性。同時(shí)，切膠的刀片保持干凈，防止污染，切膠時(shí)盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積，但務(wù)必保證將條帶膠全部切下，將切下的膠塊切小后全部收集到離心管內(nèi)。

3.加入溶解液溶膠時(shí)，在55℃-65℃的水?。ň唧w溫度由說(shuō)明書決定）中進(jìn)行，同時(shí)2-3min震蕩混勻一次，保證瓊脂糖凝膠充分溶解，否則易導(dǎo)致回收效率過(guò)低，正常全部溶解后溶液呈淡黃色。

4.過(guò)柱過(guò)程中保持柱子和回收管干凈，每一步充分離心，同時(shí)保證每一步加入正確的試劑。

5.洗脫液提前在55℃-65℃水浴中溫浴。

6.加入洗脫液前，將柱子開蓋，室溫晾5-10min左右，最大程度上將酒精揮發(fā)干凈，酒精污染也是后續(xù)影響A260/A230比值的重要因素。

7.加入洗脫液體積不宜太多，以30-50μl為宜，洗脫液太多會(huì)造成回收濃度過(guò)低，洗脫液量太少則不宜洗脫，加入洗脫液時(shí)快速垂直滴到膜中央。加入后需靜置一定長(zhǎng)的時(shí)間，充分洗脫。同時(shí)，洗脫液最后也可用實(shí)驗(yàn)用的超純水，但需保證PH值在7.0-8.5之間。

8.測(cè)濃度時(shí)，重點(diǎn)關(guān)注A260/A280的比值，以1.8-2為宜。若回收成功無(wú)污染，A260/A230比值一般在1.8以上。

9.凝膠回收試劑盒中，部分試劑需加入無(wú)水乙醇后再使用，同時(shí)注意試劑需在有效期內(nèi)。

在實(shí)際膠回收的過(guò)程中，按說(shuō)明書常規(guī)操作也會(huì)出現(xiàn)回收效率低、回收產(chǎn)物污染等情況，以我做實(shí)驗(yàn)為例，在回收過(guò)程中均按說(shuō)明書操作，測(cè)濃度時(shí)比值較低，如下圖所示：

在經(jīng)過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)比值仍未提高的基礎(chǔ)上，我們繼續(xù)往下做了后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)影響不太明顯。同時(shí)，為提高A260/A230的比值，我們?cè)诨厥战Y(jié)束后繼續(xù)做了純化，也由試劑盒完成，純化后DNA濃度會(huì)比純化前更低，但比值正常，因此在實(shí)際DNA凝膠回收的過(guò)程中，可根據(jù)回收前的DNA濃度選擇是否進(jìn)行二次純化。