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一、實(shí)驗(yàn)原理

鬼筆環(huán)肽是從毒蕈中提取的雙環(huán)七肽，對肌動(dòng)蛋白具有高度特異性和親和力，能緊密且穩(wěn)定地與纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）結(jié)合，防止其解聚。在實(shí)驗(yàn)中，先將細(xì)胞固定以維持形態(tài)，再用適當(dāng)試劑進(jìn)行通透處理，使鬼筆環(huán)肽得以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與F-actin特異性結(jié)合。同時(shí)，鬼筆環(huán)肽可與熒光染料如FITC、TRITC等進(jìn)行標(biāo)記。

當(dāng)用標(biāo)記后的鬼筆環(huán)肽處理細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下，結(jié)合了熒光染料的鬼筆環(huán)肽-F-actin復(fù)合物會發(fā)出熒光，從而清晰地顯示細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白微絲的分布與形態(tài)，便于對細(xì)胞骨架進(jìn)行觀察和研究。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1）PBS清洗細(xì)胞：細(xì)胞爬片生長24h，使其密度達(dá)到50%匯合度；用PBS洗兩遍。

2）固定細(xì)胞：用4%甲醛作固定劑，室溫下讓細(xì)胞與之接觸10-20min，甲醛滲透進(jìn)細(xì)胞，交聯(lián)蛋白、核酸，維持細(xì)胞形態(tài)，之后用PBS洗滌細(xì)胞。

3）細(xì)胞透化：固定后，用0.5%TritonX-100作透化劑，室溫靜置約5min，它可削弱細(xì)胞膜屏障，助鬼筆環(huán)肽入細(xì)胞，之后用PBS洗滌細(xì)胞。

3）鬼筆環(huán)肽染色：向細(xì)胞加熒光標(biāo)記鬼筆環(huán)肽溶液，室溫孵育20-30min，使其與F-actin精準(zhǔn)、特異性結(jié)合，利于觀察細(xì)胞骨架。

4）洗滌與封片：染色后，用PBS緩沖液多次沖洗細(xì)胞，去除多余鬼筆環(huán)肽；再用含DAPI的抗淬滅封片劑封片，防止熒光淬滅，便于顯微鏡觀測。

三、注意事項(xiàng)

1）鬼筆環(huán)肽對pH值敏感，如果pH值升高，鬼筆環(huán)肽中關(guān)鍵的硫醚橋鍵會被裂解，喪失與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合力，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2）不能使用含甲醇或丙酮的固定劑，甲醇、丙酮會嚴(yán)重破壞肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)，使其化學(xué)鍵斷裂、多肽鏈變形，喪失正常功能。

3）不能將鬼筆環(huán)肽直接應(yīng)用于活細(xì)胞的染色，因?yàn)樗鼰o法穿越細(xì)胞膜。

4）懸浮細(xì)胞因其游離特性，給染色流程增添了難度。但可借助多聚-D-賴氨酸對微孔板、蓋玻片預(yù)先進(jìn)行修飾處理，利用其帶有的正電荷與懸浮細(xì)胞表面負(fù)電荷間的相互作用，促使懸浮細(xì)胞順利附著。細(xì)胞貼壁完成后，即可套用現(xiàn)行的貼壁細(xì)胞染色方案，精準(zhǔn)、高效地達(dá)成染色目的。

例：如圖為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞（hBMSCs）骨架檢測。免疫熒光圖像顯示了不同PLGA/Mg-GA-MOF支架上hBMSC的形態(tài)。人BMSC細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）染色，細(xì)胞骨架用FITC（紅色）染色。