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摘  要

嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）產(chǎn)品屬于“活體藥物”，其作用機制和體內(nèi)行為與傳統(tǒng)藥物存在明顯不同。本文基于國內(nèi)已上市的CAR-T產(chǎn)品闡述了CAR-T產(chǎn)品的細胞動力學(xué)特點，以及獲得此類產(chǎn)品的細胞動力學(xué)數(shù)據(jù)的生物分析方法，并進一步基于作用機制及相關(guān)文獻調(diào)研情況分析了CAR-T產(chǎn)品的細胞動力學(xué)過程的影響因素。對此類產(chǎn)品細胞動力學(xué)特征的深入分析，可為后續(xù)同類產(chǎn)品體內(nèi)過程研究和基于暴露-效應(yīng)關(guān)系開展劑量探索工作奠定基礎(chǔ)。

嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）是通過基因工程技術(shù)對T細胞進行改造，使T細胞表達能夠識別特定腫瘤抗原的嵌合抗原受體，當被抗原識別和結(jié)合后，產(chǎn)生刺激信號傳至胞內(nèi)信號域，T細胞被激活并發(fā)揮功能，從而達到治療疾病的目的。隨著技術(shù)的發(fā)展，近年來CAR-T產(chǎn)品在治療惡性腫瘤和某些自身免疫性疾病方面展現(xiàn)出了巨大的潛力，但同時也面臨著因細胞因子大量釋放帶來的藥物不良反應(yīng)和/或毒性反應(yīng)以及生產(chǎn)成本過高等挑戰(zhàn)。如能基于具體CAR-T產(chǎn)品特點及人體病生理相關(guān)信息來預(yù)測其在體內(nèi)的細胞動力學(xué)特征，進一步結(jié)合生物標志物、腫瘤負荷等受試者的基線狀態(tài)情況，可能有助于幫助評估產(chǎn)品的預(yù)期療效和毒性反應(yīng)。

與傳統(tǒng)小分子化學(xué)藥物或者治療性蛋白藥物不同，CAR-T產(chǎn)品是“活”的藥物，輸注的特定陽性細胞數(shù)量與輸注后的反應(yīng)或體內(nèi)擴增能力沒有相關(guān)性，然而，其在體內(nèi)的活力及擴增情況與細胞治療產(chǎn)品的安全有效性密切相關(guān)，產(chǎn)品自身及某些生產(chǎn)因素、腫瘤或疾病負荷、患者的免疫系統(tǒng)狀態(tài)等因素可能會對此類產(chǎn)品的體內(nèi)過程產(chǎn)生影響，這也給早期臨床研究中給藥方案的制定帶來了挑戰(zhàn)。本文主要介紹CAR-T產(chǎn)品的體內(nèi)過程及生物樣本分析內(nèi)容，進一步分析影響此類產(chǎn)品體內(nèi)過程的因素，以期為給藥方案制定及后續(xù)開發(fā)提供思路。

1、 CAR-T產(chǎn)品的細胞動力學(xué)過程

細胞治療產(chǎn)品的“活的”特性導(dǎo)致其進入體內(nèi)后的過程與傳統(tǒng)化學(xué)小分子和治療性蛋白藥物不同，通常不經(jīng)歷典型的吸收、分布、代謝和排泄過程。CAR-T細胞進入體內(nèi)后一般經(jīng)歷分布、增殖（有的細胞發(fā)現(xiàn)存在分化的現(xiàn)象）、耗竭等過程。不同產(chǎn)品因具體作用機制的差異，在體內(nèi)存續(xù)時間跨度可從幾天至數(shù)年。通過體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)生產(chǎn)的CAR-T細胞進入體內(nèi)后在殺傷靶細胞的同時可不斷地進行擴增，被譽為“CAR-T細胞療法之父”的Carl June教授在2010年將CAR-T細胞推進到人體臨床試驗，在一項研究中2例獲得完全緩解的慢性淋巴細胞白血病患者在10年后仍可在外周血中定量檢測到CAR-T細胞，且未發(fā)現(xiàn)白血病復(fù)發(fā)跡象。對于通過具有靶向性的LNP遞送mRNA在體內(nèi)生成CAR-T細胞的產(chǎn)品，由于mRNA并未整合到T細胞基因組中，故其在體內(nèi)的存續(xù)時間可能僅有幾天時間，不能持續(xù)擴增，這種基于mRNA的CAR-T療法是一種短期療法，有研究團隊在探索此類產(chǎn)品用于重癥肌無力等的治療。

CAR-T類產(chǎn)品通?？梢圆捎眉毎麧舛?時間曲線來表征其進入體內(nèi)后的細胞動力學(xué)行為。一定數(shù)量的第二代抗CD19的CAR-T細胞進入體內(nèi)后首先分布至各組織，血液中的CAR-T細胞水平最初呈現(xiàn)短暫的下降（Tlag），細胞水平甚至可能降至低于定量下限，隨后CAR-T細胞開始擴增。反映在細胞動力學(xué)曲線上時，可包括分布、擴增、衰減和持續(xù)4個時相，部分細胞治療產(chǎn)品可能因體內(nèi)行為不同僅包含部分時相。

研究CAR-T產(chǎn)品的體內(nèi)過程時，可通過適宜的細胞動力學(xué)參數(shù)來表征細胞在體內(nèi)各階段的特征。目前已批準的CAR-T類產(chǎn)品常用的細胞動力學(xué)參數(shù)有Cmax、Tmax、AUC、Cmax/Tmax、Tlast、Clast等。Cmax是CAR-T細胞擴增的最高濃度水平，Tmax是達到最高濃度水平的時間，因此細胞動力學(xué)參數(shù)Cmax/Tmax可用來表征細胞在體內(nèi)的擴增速率，Clast和Tlast可用于表征細胞在體內(nèi)存續(xù)的水平及時長。美國食品藥品監(jiān)督管理局( FDA)推薦關(guān)注以下與CAR-T細胞擴增和持久性相關(guān)的細胞動力學(xué)參數(shù)：Cmax、Tmax、pAUC、Clast、Tlast、t1/2。AUC或pAUC可用來反映一段時間內(nèi)CAR-T細胞在體內(nèi)的暴露水平。傳統(tǒng)藥代動力學(xué)研究中的半衰期t1/2用于反映機體對藥物的清除速率，對于CAR-T產(chǎn)品來說，在細胞與機體的相互作用下，根據(jù)細胞動力學(xué)曲線計算得到的t1/2很大程度上依賴于采樣或隨訪時間設(shè)置，且存在較多的變異或影響因素，CARVYKTI的一項臨床研究中發(fā)現(xiàn)3例受試者在第1個CAR-T峰值后出現(xiàn)了重新擴增，如根據(jù)細胞動力學(xué)曲線計算t1/2，該數(shù)據(jù)結(jié)果可提供的價值有限，應(yīng)謹慎解讀相關(guān)結(jié)果。藥物的臨床開發(fā)過程中可選擇合適的細胞動力學(xué)參數(shù)如Cmax/Tmax、AUC（如AUC0-28 d，AUC0-96 d）等用于暴露-療效和/或暴露-安全性的分析。

為可靠地描述CAR-T細胞在體內(nèi)的動力學(xué)特征，細胞動力學(xué)樣本的采樣計劃要有足夠多的時間點，尤其是在擴增階段應(yīng)該考慮設(shè)計相對密集的采樣計劃。由于細胞治療產(chǎn)品在體內(nèi)的存活及增殖/擴增過程復(fù)雜，其暴露水平在患者間的變異與化學(xué)小分子藥物或傳統(tǒng)生物制劑相比會更大。進行細胞動力學(xué)評價時應(yīng)根據(jù)具體情況選擇適宜的細胞動力學(xué)參數(shù)，并根據(jù)產(chǎn)品特點和作用機制對相關(guān)參數(shù)進行合理解讀。

2、 細胞動力學(xué)樣品檢測

獲得可靠的血藥濃度數(shù)據(jù)是細胞動力學(xué)評價的基礎(chǔ)和前提，應(yīng)根據(jù)具體產(chǎn)品采用適宜的檢測手段對細胞動力學(xué)樣品進行分析。如果一種方法不能完全反映細胞在體內(nèi)的細胞動力學(xué)特性，可采用多種方法監(jiān)測細胞在體內(nèi)的增殖和存活情況，通過對特定基因拷貝數(shù)和特定陽性細胞數(shù)量進行細胞動力學(xué)樣本的檢測，有助于互相驗證檢測方法的可靠性，可更全面地分析產(chǎn)品在體內(nèi)的擴增和存活情況?？刹捎玫姆椒ㄓ谢诜肿訖z測的實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）或數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（dPCR)和基于表型檢測的流式細胞術(shù)等，此外，熒光和放射性標記成像也可用于監(jiān)測CAR-T的細胞動力學(xué)。

流式細胞術(shù)檢測通常報告轉(zhuǎn)基因表達細胞的結(jié)果，以所測量的總細胞中特定陽性細胞的百分比表示。對于基于qPCR的評估，通常是以每微克(μg)DNA的拷貝數(shù)表示，此外PCR檢測結(jié)果也可以表示為每毫升（mL）的拷貝數(shù)。為了比較從表型和分子測量中獲得的結(jié)果，可以基于體積應(yīng)用轉(zhuǎn)換因子。為解決自體CAR-T細胞開發(fā)時生產(chǎn)成本高以及耗時長的挑戰(zhàn)，通用型CAR-T也逐漸受到較多的關(guān)注。通用型CAR-T產(chǎn)品開發(fā)的方法之一是通過基因編輯技術(shù)重新設(shè)計供者αβT細胞，使其與受者相容避免發(fā)生移植免疫排斥反應(yīng)。另一種方法是利用先天免疫細胞（如自然殺傷細胞和γδT細胞）來開發(fā)CAR-T產(chǎn)品。用于通用型CAR-T產(chǎn)品的細胞動力學(xué)考察的生物分析計劃需針對所使用的特定免疫細胞亞群來開發(fā)。

流式細胞術(shù)用熒光試劑（通常是單克隆抗體）標記細胞懸液，通過每個細胞的熒光特征進行細胞分群以確定CAR-T細胞的數(shù)量。用于檢測細胞表面CAR表達的試劑主要包括針對CAR的單鏈可變區(qū)片段（scFV）結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白結(jié)合蛋白（蛋白L）或目標抗原本身等多種特異性單克隆抗體。由于CAR-T細胞的水平通常低于患者的總細胞數(shù)量，用于鑒定目標細胞的試劑的特異性和選擇性因而非常重要。用流式細胞術(shù)考察細胞動力學(xué)的另一個特點是其檢測限通常高于qPCR、dPCR等PCR方法。采用流式細胞術(shù)檢測不到目標細胞時可能并不代表細胞中目標蛋白未表達，而可能是該方法檢測靈敏度低導(dǎo)致。因此，有可能在基于PCR的基因擴增試驗中檢測到轉(zhuǎn)導(dǎo)基因，但流式細胞術(shù)沒有檢測到相關(guān)細胞。雖然流式細胞術(shù)存在靈敏度低的局限性，但由于它能提供活的/有功能的CAR-T細胞的數(shù)量的結(jié)果也有一定的潛在優(yōu)勢，并且流式細胞術(shù)的表型測量通常也可用于對細胞亞群中免疫表型和CD4+/CD8+細胞比率等項目進行表型表征。

由于更高的靈敏度、易于采樣、可重復(fù)性、取樣量少等優(yōu)點，基于PCR的方法也被廣泛用于監(jiān)測CAR-T產(chǎn)品的細胞動力學(xué)。與流式細胞術(shù)的方法相比，qPCR的方法因耗時較長限制了實時分析的可能，并由于選擇性較低，使其不能區(qū)分表達CAR的細胞和含有CAR轉(zhuǎn)基因拷貝但不能表達受體的T細胞?；赑CR的方法中，dPCR可提供更高的靈敏度，無需標準曲線可對目標DNA進行絕對定量，通過把模板分散到各個反應(yīng)微單元降低了抑制藥對擴增的影響，但由于需要根據(jù)不同的模板序列合成不同的探針成本也相對較高。在確定是否使用qPCR或dPCR檢測細胞動力學(xué)樣本時，應(yīng)考慮檢測所需的靈敏度和動態(tài)范圍，通常qPCR較dPCR可提供更寬的動態(tài)范圍，在研究過程中檢測平臺應(yīng)保持一致。

3、 國內(nèi)已上市CAR-T產(chǎn)品的細胞動力學(xué)特征

目前國內(nèi)已上市6款CAR-T產(chǎn)品，其中阿基奧侖賽注射液、瑞基奧侖賽注射液、納基奧侖賽注射液和澤沃基奧侖賽注射液的靶點為CD19，伊基奧侖賽注射液和西達基奧侖賽注射液的靶點為B細胞成熟抗原（BCMA）。這些產(chǎn)品經(jīng)靜脈輸注給藥后約在7~14 d在體內(nèi)達到最大暴露水平，其中瑞基奧侖賽的說明書顯示在不同適應(yīng)證患者中達到最大暴露水平的時間略有差異。國內(nèi)批準上市的CAR-T產(chǎn)品的說明書顯示，經(jīng)靜脈輸入體內(nèi)后，CAR-T細胞可在體內(nèi)長期存在。截至最初上市批準時，西達基奧侖賽在體內(nèi)的存續(xù)時間可達25.3個月。阿基奧侖賽、伊基奧侖賽和澤沃基奧侖賽明確在相關(guān)適應(yīng)證中獲得緩解的患者體內(nèi)抗CAR-T細胞Cmax和AUC的中位水平較未緩解者會更高。瑞基奧侖賽在成人復(fù)發(fā)/難治性大B細胞淋巴瘤和成人復(fù)發(fā)/難治性濾泡性淋巴瘤患者血液中CAR-T細胞的數(shù)量與3個月客觀緩解（完全緩解或部分緩解）未見顯著相關(guān)性，在成人復(fù)發(fā)/難治性套細胞淋巴瘤獲得客觀緩解的患者體內(nèi)CAR-T細胞的Cmax和AUC1-29高于未獲得客觀緩解的患者，瑞基奧侖賽的觀察結(jié)果可能與樣本量有關(guān)，但也在一定程度上提示，同一產(chǎn)品在不同病理組織學(xué)特征狀態(tài)下的細胞動力學(xué)可能存在差異。這在HAMILTON等的研究中也有證明，在接受TECARTUS治療套細胞淋巴瘤的患者中，CD19 CAR-T擴增和持續(xù)性較治療大B細胞淋巴瘤更高，提示該產(chǎn)品在體內(nèi)的擴增具有疾病組織學(xué)依賴性。納基奧侖賽外周血中CAR-T細胞的Cmax和AUC0-28 d與最佳療效（是否達到完全緩解或完全緩解伴不完全血液學(xué)恢復(fù)）未見顯著相關(guān)性。

在CAR-T治療時，發(fā)生細胞因子釋放綜合征（CRS）或免疫效應(yīng)細胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（ICANS）后可能會根據(jù)嚴重程度用到托珠單抗和/或皮質(zhì)類固醇來治療。所有產(chǎn)品均顯示，用到皮質(zhì)類固醇患者的暴露水平（Cmax和/或AUC）高于未使用皮質(zhì)類固醇的患者。除西達基奧侖賽外，其他5個產(chǎn)品的說明書顯示，使用托珠單抗的患者的暴露水平高于未使用的患者。FDA公布的相關(guān)產(chǎn)品的審評報告顯示，類固醇及托珠單抗的使用是臨床藥理關(guān)注的重點?；仡櫺苑治霰砻?，早期使用托珠單抗并不影響CAR-T細胞的Cmax、AUC0-28 d、持久性或完全緩解率。皮質(zhì)類固醇也不會導(dǎo)致CAR-T細胞Cmax、AUC0-28 d或臨床緩解率的顯著降低。但由于皮質(zhì)類固醇通常僅在嚴重的托珠單抗難治性CRS或ICANS患者中使用，而這些患者中通常已經(jīng)發(fā)生快速的CAR-T細胞擴增。因此，不能排除皮質(zhì)類固醇對早期CAR-T細胞擴增或?qū)鼓[瘤反應(yīng)的持久性產(chǎn)生影響。

由于CAR-T細胞的增殖水平高度依賴于靶抗原，CAR-T細胞通過“CAR”精準識別并結(jié)合腫瘤細胞表面的特異性抗原（如CD19、BCMA等），從而激活CAR-T細胞，達到殺傷靶細胞和擴增CAR-T細胞的目的。靶抗原的持續(xù)存在是CAR-T細胞得以持續(xù)擴增并充分發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵要素。國內(nèi)部分已上市產(chǎn)品的說明書中也針對腫瘤負荷對細胞動力學(xué)的影響做了相關(guān)說明，其中納基奧侖賽基線期腫瘤負荷>50%患者外周血中CAR-T細胞的Cmax中位值和AUC0-28 d中位值均高于腫瘤負荷≤50%患者的相應(yīng)參數(shù)，分別為1.31倍和2.39倍。但伊基奧侖賽基線期腫瘤負荷和橋接治療對本品的Cmax和AUC無顯著影響。雖然腫瘤負荷相對較高的人群中傾向于CAR-T細胞的擴增，但由于高腫瘤負荷本身可能是預(yù)后不良的一個重要因素，因此這類患者中細胞擴增水平或細胞暴露水平并不一定與患者預(yù)后存在正相關(guān)性。高腫瘤負荷的患者中既需要維持CAR-T細胞的擴增，但為了避免大量擴增帶來的毒性風險，也需要盡量控制細胞的擴增速度，即CAR-T細胞以適宜的擴增速度來平衡疾病控制和細胞因子釋放帶來的毒性。

除了合并使用藥物（如托珠單抗、皮質(zhì)類固醇）和腫瘤負荷會影響CAR-T產(chǎn)品的細胞動力學(xué)外，免疫原性、患者的免疫狀態(tài)、清淋預(yù)處理等多種因素都有可能影響此類產(chǎn)品在體內(nèi)的擴增情況，但可能會因細胞動力學(xué)參數(shù)的高度變異性而難以通過群體藥代動力學(xué)的方法篩選出單一影響因素。對于特定的細胞動力學(xué)數(shù)據(jù)可能是多種因素的綜合作用結(jié)果。綜合以上暴露-效應(yīng)關(guān)系以及相關(guān)因素對細胞動力學(xué)的影響情況，適宜的體內(nèi)暴露水平是CAR-T產(chǎn)品治療疾病過程中平衡毒性和療效的關(guān)鍵，在探索適宜的暴露水平時需同時考慮產(chǎn)品特點、患者自身疾病狀態(tài)以及治療干預(yù)等多種因素綜合考慮。

4、 討  論

目前國內(nèi)外已獲批上市的CAR-T產(chǎn)品的暴露-效應(yīng)關(guān)系分析顯示，響應(yīng)者的體內(nèi)CAR-T暴露水平要高于未響應(yīng)者。同時發(fā)生高級別CRS事件的受試者的暴露水平也高于發(fā)生低級別CRS事件的受試者。因此CAR-T產(chǎn)品在體內(nèi)的暴露情況既影響療效也與毒性相關(guān)，而CAR-T的細胞動力學(xué)具有高度變異性，因此考察CAR-T細胞的細胞動力學(xué)特點，明確識別各項影響細胞動力學(xué)的內(nèi)在和外在因素，對制定平衡療效和毒性的給藥方案有重要意義。

由于CAR-T產(chǎn)品進入體內(nèi)后通過復(fù)雜生物信號通路調(diào)控發(fā)揮治療作用并可以繼續(xù)增殖，導(dǎo)致此類產(chǎn)品的體內(nèi)過程不適合以傳統(tǒng)藥代動力學(xué)（即機體對藥物的處置）的思路來考慮。但借鑒傳統(tǒng)藥代動力學(xué)的方法，可以通過細胞濃度-時間曲線的形式來表征細胞進入體內(nèi)后的動力學(xué)變化過程來對其進行研究，細胞動力學(xué)曲線反映的是CAR-T細胞與機體相互作用的結(jié)果，因此CAR-T產(chǎn)品的體內(nèi)過程必將受到來自生理狀況、治療干預(yù)、產(chǎn)品自身特點等因素的影響。由于產(chǎn)品及體內(nèi)過程的復(fù)雜性，上文中關(guān)于細胞動力學(xué)影響因素的分析可能也不全面，還需要更多的研究證據(jù)進一步完善。

隨著技術(shù)的發(fā)展，通用型CAR-T、體內(nèi)生成CAR-T等多樣化的CAR-T產(chǎn)品已進入臨床開發(fā)階段。在影響因素混雜的情況下，可能難以通過經(jīng)驗的方法來判斷產(chǎn)品進入體內(nèi)后的變化趨勢，基于機制的定量藥理學(xué)方法或許能幫助理解和預(yù)測CAR-T產(chǎn)品在體內(nèi)的動力學(xué)過程。有研究人員用定量系統(tǒng)藥理學(xué)（QSP）方法定量分析了靶向CD-19的CAR-T產(chǎn)品劑量、疾病負荷和促炎細胞因子之間的復(fù)雜關(guān)系，對臨床療效和安全性影響因素的分析顯示，CAR-T的擴增和B細胞的消除與疾病負荷的相關(guān)性比CAR-T產(chǎn)品的給藥劑量更高，該結(jié)論與相關(guān)研究中觀察到的情況相似。QSP模型的應(yīng)用在一定程度上可幫助更好地理解CAR-T產(chǎn)品的作用機制與臨床結(jié)局之間的聯(lián)系，從而指導(dǎo)CAR-T產(chǎn)品的開發(fā)和劑量優(yōu)化。