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一、細(xì)胞內(nèi)一氧化氮（NO）的簡介

細(xì)胞內(nèi)一氧化氮（NO）是一種在細(xì)胞內(nèi)由一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸生成小分子氣體，通常有三種亞型包括神經(jīng)型（nNOS）、誘導(dǎo)型（iNOS）和內(nèi)皮型（eNOS）。nNOS和eNOS在生理?xiàng)l件下通常會(huì)產(chǎn)生少量的NO維持正常的生理功能，比如在血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)血管張力等的作用。

另外，iNOS在炎癥等病理刺激下可大量產(chǎn)生NO；在巨噬細(xì)胞炎癥模型中NO具有殺菌作用，因此在一些因素導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)中我們通常會(huì)檢測(cè)iNOS或者NO的含量作為細(xì)胞表型變化的指標(biāo)之一，但因iNOS的變化不明顯通常檢測(cè)NO的含量。

二、細(xì)胞內(nèi)NO的檢測(cè)方法

1、熒光探針法：常用的熒光探針有DAF-FMDA等。

（1）原理：DAF-FMDA本身沒有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解生成具有熒光特性的DAF-FM。在有NO存在時(shí)，DAF-FM會(huì)與NO反應(yīng)生成具有更強(qiáng)熒光的三唑熒光產(chǎn)物，通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或熒光分光光度計(jì)等儀器檢測(cè)熒光強(qiáng)度，從而反映細(xì)胞內(nèi)NO的水平。

（2）優(yōu)點(diǎn)：靈敏度較高，能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO的動(dòng)態(tài)變化；對(duì)細(xì)胞損傷較小。

（3）缺點(diǎn)：一些細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)可能會(huì)對(duì)熒光探針產(chǎn)生干擾，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2、化學(xué)發(fā)光法

（1）原理：利用NO與臭氧（O?）反應(yīng)生成激發(fā)態(tài)的NO?，當(dāng)激發(fā)態(tài)的NO?回到基態(tài)時(shí)會(huì)發(fā)出特定波長的光，通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)量光強(qiáng)度來定量NO。

（2）優(yōu)點(diǎn)：具有較高的靈敏度和特異性，能夠檢測(cè)極低濃度的NO。

（3）缺點(diǎn)：儀器設(shè)備較為昂貴，操作相對(duì)復(fù)雜，且需要對(duì)樣本進(jìn)行特殊處理。

3、比色法

（1）原理：例如使用Griess試劑，NO在體內(nèi)或體外被氧化生成硝酸鹽（NO??）和亞硝酸鹽（NO??），Griess試劑可與亞硝酸鹽反應(yīng)生成有色化合物，通過分光光度計(jì)在特定波長下測(cè)量吸光度來定量亞硝酸鹽，進(jìn)而間接反映NO的水平。

（2）優(yōu)點(diǎn)：操作相對(duì)簡單，成本較低。

（3）缺點(diǎn)：只能檢測(cè)NO的氧化產(chǎn)物，不能直接檢測(cè)NO本身，而且檢測(cè)的是NO的累積量，無法反映實(shí)時(shí)的NO水平。

三、比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO（碧云天試劑盒）

在這里我們主要介紹一下快速簡便的比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO的實(shí)驗(yàn)步驟：

（1）從冰箱取出試劑盒使回復(fù)室溫；試劑盒中包含1M NaNO2、Griess Reagent I和II三種試劑。

（2）用RPMI 1640+10%血清FBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品(1-100μM)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度可取0,1,2,5,10,20,40,60,100μM。

1M NaNO2稀釋：

稀釋100×：990μL RPMI 1640+FBS+10μL 1M NaNO2(1mL 10mM NaNO2)

稀釋100×：15μL 10Mm NaNO2+1485μL RPMI 1640(1.5mL 100μM NaNO2)

以下濃度用1.5mL 100μM NaNO2進(jìn)行稀釋：

（3）待測(cè)樣品處理，吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清至1.5ml離心管中，12000×g，5min去除細(xì)胞碎片和其他沉淀物。

（4）按50μl /孔，在96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品。

（5）按50μl/孔，在各孔中加入室溫Griess Reagent I。

（6）按50μl /孔，各孔中加入室溫Griess Reagent II。

（7）用酶標(biāo)儀540nm測(cè)定吸光度。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品加入Griess Reagent I、Griess Reagent II孵育后

圖2  樣品加入Griess Reagent I、Griess Reagent II孵育后

（8）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算出樣品中一氧化氮NO的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線示例如下圖：

（9）利用制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣本（細(xì)胞上清）中NO 的含量：

1）利用EXCEL將得到標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2要求在0.99以上，否則需要重新制備標(biāo)準(zhǔn)品樣本進(jìn)行檢測(cè)；

2）計(jì)算待測(cè)樣品NO的濃度，要求測(cè)得吸光度的值在標(biāo)準(zhǔn)曲線OD值范圍內(nèi)，否則需要重新制備樣品進(jìn)行檢測(cè)；

3）計(jì)算X(NO濃度)：代入公式X=（Y(待測(cè)樣品吸光度值)-B）/A

4）結(jié)果分析：理論上，所測(cè)OD值與待測(cè)樣本NO的 濃度成正比。其中在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，OD值越大，樣品產(chǎn)生的NO濃度越高，NO濃度也高顯色越深，相反顏色越淺。

四、注意事項(xiàng)

1、試劑的純度要高，且在有效期內(nèi)使用，避免因試劑變質(zhì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)為去離子水或超純水，以防止水中的雜質(zhì)干擾實(shí)驗(yàn)。

2、加入試劑的量要準(zhǔn)確，且充分混勻，以保證反應(yīng)的充分性和一致性。

3、及時(shí)用酶標(biāo)儀檢測(cè)，控制在5min之內(nèi)。顯色反應(yīng)的溫度和時(shí)間要嚴(yán)格控制，不同的顯色反應(yīng)有其適宜的溫度和時(shí)間范圍，應(yīng)根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行調(diào)整。

4、進(jìn)行多次平行實(shí)驗(yàn)，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差等統(tǒng)計(jì)參數(shù)。

5、設(shè)置空白對(duì)照，即在不加樣品的情況下，按照相同的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，以消除實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)自身帶來的誤差等。

6、檢測(cè)結(jié)果應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，若超出范圍，需對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋或濃縮后重新測(cè)定。

7、分開加樣進(jìn)入96孔板時(shí)需要主要不要產(chǎn)生氣泡，產(chǎn)生氣泡時(shí)我們可以使用熱吹風(fēng)機(jī)短時(shí)間消除，輕輕震動(dòng)板子混勻樣品盒試劑。