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雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)（Dual Luciferase Reporter Assay System）是一種常用于評估基因調(diào)控元件（如啟動子、增強子或microRNA靶點）活性的實驗方法。該系統(tǒng)通常涉及兩個質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，其目的是為了提供更準(zhǔn)確和可靠的實驗數(shù)據(jù)。這兩個質(zhì)粒及其作用如下：

1. 報告質(zhì)粒（Reporter Vector）：

這個質(zhì)粒包含了待研究的調(diào)控序列上游的螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase, Fluc）基因。這個調(diào)控序列可以是啟動子、增強子或其他順式作用元件。

當(dāng)細胞被轉(zhuǎn)染后，如果調(diào)控序列活躍，則會驅(qū)動螢火蟲熒光素酶基因的表達。通過測量螢火蟲熒光素酶的活性，我們可以間接了解目標(biāo)調(diào)控序列的功能或活性水平。

2. 內(nèi)參質(zhì)粒（Control Vector）：

內(nèi)參質(zhì)粒通常攜帶海腎熒光素酶（Renilla luciferase, Rluc）基因，作為內(nèi)部對照使用。它不受實驗處理的影響，并且在實驗設(shè)計中保持恒定表達。

海腎熒光素酶的作用是標(biāo)準(zhǔn)化實驗結(jié)果，以校正由于細胞數(shù)量差異、轉(zhuǎn)染效率變化或其它實驗條件波動帶來的影響。通過比較兩種熒光素酶的相對活性，可以獲得更加可靠的數(shù)據(jù)。

通過同時轉(zhuǎn)染這兩個質(zhì)粒并檢測兩種不同類型的熒光素酶活性，研究人員可以得到關(guān)于特定調(diào)控序列功能的信息，同時確保實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。這種方法廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究中，尤其是在探索基因表達調(diào)控機制時。

一、基本實驗流程圖

二、實驗步驟

1、報告基因質(zhì)粒構(gòu)建：將目的片段插入到熒光素酶表達的報告基因載體上，如pGL3-basic、Psicheck-2等常見載體。通常是把目的基因結(jié)合區(qū)域或者基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上游，構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒。

2、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：選擇合適的細胞系，如常用的工具細胞HEK293T等，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37°C、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達到70%~80%時進行轉(zhuǎn)染。

3、共轉(zhuǎn)染：將構(gòu)建好的報告基因質(zhì)粒和帶有海腎熒光素酶基因的內(nèi)參質(zhì)粒，按照一定比例使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等方法共同轉(zhuǎn)染入細胞。

以miRNA靶基因驗證為例 ：

4、細胞裂解：轉(zhuǎn)染后48h左右，去除培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞1~2次，加入細胞裂解液，室溫裂解細胞15~30min左右，以保證細胞充分裂解。

5、熒光素酶活性測定：初次使用時，需配制Firefly Luciferase（螢火蟲熒光素酶）的底物，將其溶解在LARII buffer（Buffer 1）中，并分裝-80℃避光保存；同時現(xiàn)用現(xiàn)配Stop & Glo（Buffer 2），即Renilla Luciferase（海參熒光素酶）的底物，用于終止LARII buffer（Buffer 1）的反應(yīng)。

6、檢測讀數(shù)：向一定量（如40μl）的LARII中加入適量（如10μl）細胞裂解液，吹打混勻后，立即用酶標(biāo)儀檢測讀數(shù)，即為Firefly luciferase的值；接著加入等量的Stop & Glo，再次讀數(shù)，即為Renilla Luciferase的值。

7、數(shù)據(jù)處理與分析：計算每管的Firefly Luciferase/Renilla Luciferase的比值，再以control組的比值為單位，得到不同處理組的相對luciferase活性，以此來反映該處理組基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控活性。通常采用t檢驗或方差分析等統(tǒng)計方法進行數(shù)據(jù)分析，比較各樣品間相對熒光值的差異，判斷目的基因?qū)晒馑孛富钚缘挠绊懯欠耧@著。

8、結(jié)果分析和解讀：

（1）相對熒光素酶活性（Relative Luciferase Activity，RLA）的計算方法，即RLA=螢火蟲熒光素酶活性值（Fluc值）/海腎熒光素酶活性值（Rluc值）。以miRNA靶基因驗證為例 ：計算步驟步驟如下：

1.先計算出每孔的Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase的比值(F/R);

2.求出miRNA-Ctrl三個重復(fù)孔的平均值(average1)

3.再以miRNA-Ctrl組的average1為標(biāo)準(zhǔn)1進行標(biāo)準(zhǔn)化，即用miRNA mimic組的F/R三個重復(fù)值分別除以相對應(yīng)組別average1得到三個比值

4.3.中求出的比值的平均值作為average2，并分別用average1和average2的值作柱狀圖

表1 歸一化數(shù)據(jù)處理

（2）以對照組為參照分析相對活性變化

1）雙熒光素酶活性升高：若實驗組的RLA值顯著高于對照組，例如對照組RLA為1，實驗組RLA為3，通常提示所研究的調(diào)控元件對報告基因（螢火蟲熒光素酶）的轉(zhuǎn)錄具有激活作用，即可能促進了目標(biāo)基因的表達啟動或增強了表達水平。

2）雙熒光素酶活性降低：當(dāng)實驗組的RLA值明顯低于對照組時，比如對照組RLA為1，實驗組RLA為0.5，則表明該調(diào)控元件可能抑制了報告基因的轉(zhuǎn)錄，使目標(biāo)基因表達量相對減少。

3）無顯著差異：若實驗組與對照組的RLA值相近，且經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析不存在顯著差異，說明在所設(shè)定的實驗條件下，該調(diào)控元件對目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄可能沒有明顯的調(diào)控作用。

三、經(jīng)驗總結(jié)

1、試劑準(zhǔn)備與保存：螢火蟲熒光素酶底物L(fēng)ARII需按需分裝，-80℃避光保存，避免反復(fù)凍融；海腎熒光素酶底物Stop&Glo需現(xiàn)配現(xiàn)用。配好的LARII在-20℃可穩(wěn)定一個月，在-70℃可穩(wěn)定一年。

2、細胞轉(zhuǎn)染：注意轉(zhuǎn)染試劑的質(zhì)量和使用說明，不同細胞系對轉(zhuǎn)染試劑的敏感性可能不同，可進行預(yù)實驗優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，如轉(zhuǎn)染試劑的用量、細胞密度、轉(zhuǎn)染時間等。

3、設(shè)立陽性和陰性對照，以確保轉(zhuǎn)染的成功和實驗結(jié)果的可靠性。例如，可設(shè)置轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照和已知有相互作用的陽性對照組合。

4、實驗操作過程：整個實驗過程要注意避光，尤其是在試劑配制、細胞裂解后以及熒光檢測過程中，防止熒光素酶底物見光分解影響檢測結(jié)果。

5、實驗操作盡量在短時間內(nèi)完成，一般建議在30min內(nèi)，以減少細胞裂解產(chǎn)物等在室溫下放置時間過長可能導(dǎo)致的活性變化。

6、樣品和測定試劑混合后到測定前的時間應(yīng)盡量控制在相同時間內(nèi)，通常1~2s，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。

7、結(jié)果分析與問題排查：如果測量的熒光值較低，首先排除轉(zhuǎn)染效率問題，可通過在12孔板多鋪一孔細胞轉(zhuǎn)染熒光質(zhì)粒，觀察轉(zhuǎn)染的熒光效率；若排除轉(zhuǎn)染問題后熒光讀值仍然較低，可以嘗試增加轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量。

8、若測量的熒光值過高，則可減少轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量，或者適當(dāng)稀釋細胞裂解離心后的上清液。

9、若背景過高可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，需檢查試劑是否被污染、細胞是否有自發(fā)熒光等問題，并采取相應(yīng)的解決措施。