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基因過表達(dá)即將目的基因的編碼序列克隆到相應(yīng)的質(zhì)粒或病毒載體上，從而使基因在人為控制的情況下實(shí)現(xiàn)大量轉(zhuǎn)錄和翻譯，實(shí)現(xiàn)基因的過表達(dá)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中載體構(gòu)建是整個(gè)實(shí)驗(yàn)的開始。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.PCR目的基因片段（如已有目的基因片段可忽略）：

選擇細(xì)胞提RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)PCR酶配置相應(yīng)體系進(jìn)行PCR，得到相應(yīng)的目的基因片段，同時(shí)跑瓊脂糖凝膠進(jìn)行酶切鑒定，根據(jù)目的基因的片段大小判斷條帶應(yīng)該出現(xiàn)的位置，根據(jù)位置判斷酶切目的基因片段是否成功。

2.雙酶切目的基因：

酶切位點(diǎn)選擇和過表達(dá)載體相同的酶切位點(diǎn)，常見酶切體系如下：

37℃酶切1h。

3.雙酶切過表達(dá)載體（以常見的過表達(dá)載體plvx-IRES-neo為例）：

選擇和目的基因片段相同的酶切位點(diǎn)，以相同條件進(jìn)行酶切，酶切完成后需跑瓊脂糖凝膠鑒定載體酶切是否成功，同時(shí)進(jìn)行膠回收并測定相應(yīng)濃度。

4.酶切后載體與目的基因連接：

常見連接體系如下：

16℃連接4 h或過夜，連接完成后產(chǎn)物可暫存于冰箱4℃。

5.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、搖菌、測序：

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化搖菌及提質(zhì)粒均按常規(guī)步驟操作即可，質(zhì)粒提取結(jié)束根據(jù)濃度取一定微升的原液送公司測序，查看載體構(gòu)建是否成功。

注意事項(xiàng)：

1.上述步驟中涉及多次瓊脂糖凝膠鑒定，配置瓊脂糖凝膠時(shí)遵循目的基因片段越長，膠濃度約低的原則，目的基因及載體片段大小應(yīng)提前進(jìn)行查詢。

2.PCR目的基因片段時(shí)，應(yīng)提前設(shè)計(jì)好相應(yīng)引物，我所使用的酶為KOD酶，根據(jù)說明書配置體系即可。

3.目的基因及載體的雙酶切位點(diǎn)可從文獻(xiàn)中查詢或聽取導(dǎo)師意見，酶緩沖液的選擇可在NEB官網(wǎng)中進(jìn)行查詢，同時(shí)酶切時(shí)間及條件由內(nèi)切酶自身決定。

4.連接過程中我所舉例的酶為T4連接酶，連接酶的選擇根據(jù)自身?xiàng)l件決定，但需注意選擇用哪個(gè)公司的連接酶，其緩沖液應(yīng)配套使用，防止降低連接效率，同時(shí)加樣量并不固定，實(shí)驗(yàn)開始前需仔細(xì)進(jìn)行計(jì)算。

5.在配置酶切及連接體系時(shí)酶應(yīng)在最后加，實(shí)驗(yàn)開始前應(yīng)混勻。