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前言

 

細(xì)胞庫檢定和病毒清除驗(yàn)證由于涉及到病毒檢項(xiàng)，企業(yè)一般會(huì)選擇第三方服務(wù)商來處理。但是由于中國(guó)和歐美在這個(gè)項(xiàng)目上的法規(guī)不同，導(dǎo)致需要同時(shí)考慮海外市場(chǎng)的企業(yè)要花額外的精力去設(shè)計(jì)一個(gè)滿足雙報(bào)需求的方案。2020年1月21日，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（簡(jiǎn)稱：NMPA）發(fā)布“國(guó)家藥監(jiān)局關(guān)于適用《Q2（R1）：分析方法論證：正文和方法學(xué)》等11個(gè)國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)指導(dǎo)原則的公告（2020年第7號(hào)）”。公告明確：本公告發(fā)布之日起6個(gè)月后（即：2020年7月10日）開始的藥學(xué)研究（以試驗(yàn)記錄時(shí)間點(diǎn)為準(zhǔn)），適用ICH指導(dǎo)原則, 其中包含了ICH Q5A (R1)和Q5B。這表明了國(guó)內(nèi)法規(guī)和歐美法規(guī)有趨同的趨勢(shì)，也對(duì)雙報(bào)項(xiàng)目病毒安全性的管理產(chǎn)生了影響。此外2020年新版藥典即將發(fā)布，在此，也根據(jù)征求意見稿的情況加以討論。

 

簡(jiǎn)介

 

使用細(xì)胞（人源或動(dòng)物源）生產(chǎn)的生物技術(shù)產(chǎn)品的一個(gè)共同特點(diǎn)是存在病毒污染的危險(xiǎn)性，這種病毒污染在臨床上可產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。病毒污染可來自細(xì)胞系(細(xì)胞基質(zhì))本身，也可來自生產(chǎn)過程中偶然帶入的外源病毒。病毒安全性始終是產(chǎn)品質(zhì)量研究的一項(xiàng)重要環(huán)節(jié)，一般通過細(xì)胞庫檢定、原輔料測(cè)試以及純化工藝的病毒清除驗(yàn)證來保證工藝過程中的生物安全性。但是，由于國(guó)內(nèi)外申報(bào)所依據(jù)的法規(guī)不同，具體要求也會(huì)有所差異。

 

其中，ICH Q5A（R1）：《來源于人或動(dòng)物細(xì)胞系的生物技術(shù)產(chǎn)品的病毒安全性評(píng)價(jià)》是關(guān)于國(guó)外生物技術(shù)產(chǎn)品申報(bào)材料病毒安全性評(píng)價(jià)的主要參照法規(guī)。另外，對(duì)于FDA申報(bào)，美國(guó)藥典、Pointsto Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products forHuman Use、Pointsto Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals以及9 CFR等也是需要參照的法規(guī)；同樣，對(duì)于EMA來說，需要參照歐洲藥典、Guidelineon Virus Safety Evaluation of Biotechnological IMP等一系列相關(guān)法規(guī)。而中國(guó)國(guó)內(nèi)申報(bào)主要依據(jù)《中國(guó)藥典》第三部（2015版）“生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”和《生物組織提取制品和真核細(xì)胞表達(dá)制品的病毒安全性評(píng)價(jià)技術(shù)審評(píng)一般原則》。這種評(píng)價(jià)依據(jù)差異情況使得中外雙報(bào)的項(xiàng)目需要充分考慮中國(guó)和海外申報(bào)區(qū)域法規(guī)的不同，而不能簡(jiǎn)單地將一套數(shù)據(jù)應(yīng)用在另一個(gè)地方。

 

本文將從（1）對(duì)細(xì)胞系和其他原材料進(jìn)行選擇和測(cè)試，確保其不含可能對(duì)人有感染和/或致病作用的病毒。（2）對(duì)生產(chǎn)工藝中清除病毒的能力進(jìn)行評(píng)估。等兩個(gè)方面，對(duì)中外申報(bào)材料中病毒安全性評(píng)價(jià)的差異和趨勢(shì)進(jìn)行論述。

 

細(xì)胞系和其他原材料的病毒檢測(cè)

在生產(chǎn)生物制品時(shí)，需要建立多級(jí)細(xì)胞庫，包括原始細(xì)胞庫（PCB），主細(xì)胞庫（MCB），工作細(xì)胞庫（WCB）以及生產(chǎn)終末細(xì)胞庫（EOPC）等。不同的細(xì)胞庫所具有的功能不同，ICH以及各國(guó)的法規(guī)對(duì)其病毒檢定的要求也是不同的。

 

（1）其中ICHQ5A(R1)規(guī)定不同級(jí)別細(xì)胞進(jìn)行的病毒測(cè)試方法（表一）：

	MCB	WCB	代次限制細(xì)胞a
逆轉(zhuǎn)錄病毒和其他內(nèi)源病毒的測(cè)試
感染性試驗(yàn)	+	-	+
電鏡	+b	-	+d
逆轉(zhuǎn)錄酶	+c	-	+c
其他特異病毒試驗(yàn)	如適用d	-	如適用d
非內(nèi)源性或外源病毒測(cè)試
體外測(cè)定	+	-e	+
體內(nèi)測(cè)定	+	-e	+
抗體產(chǎn)生檢測(cè)	+f	-	-
其他特異病毒檢測(cè)	+g	-	-

 

a 達(dá)到限傳代次的細(xì)胞:在體外達(dá)到傳代限度的生產(chǎn)細(xì)胞

 

b 也可測(cè)定其他因子。

 

c 若逆轉(zhuǎn)錄病毒感染試驗(yàn)為陽性，則無須作。

 

d 指適用于已受此因子感染的細(xì)胞系。

 

e 第一個(gè)WCB時(shí)，此測(cè)試應(yīng)在該WCB產(chǎn)生的達(dá)到體外限傳代次細(xì)胞上進(jìn)行；以后的WCB，可直接在WCB上進(jìn)行單項(xiàng)體外和體內(nèi)測(cè)試，或在達(dá)到體外限傳代次的細(xì)胞上測(cè)試。

 

f 例如MAP、RAP、HAP--通常適用于嚙齒細(xì)胞系。

 

g 例如，適用于人、非人靈長(zhǎng)目或其他細(xì)胞的測(cè)試方法。

 

（2）中國(guó)藥典第三部（2015版）（表二）：

檢測(cè)項(xiàng)目		MCB	WCB	EOPC①
內(nèi)、外源病毒污染檢查	細(xì)胞形態(tài)觀察及血吸附試驗(yàn)	+	+	+
	體外不同細(xì)胞接種培養(yǎng)法	+	+	+
	動(dòng)物和雞胚體內(nèi)接種法	+	-	+
	逆轉(zhuǎn)錄病毒檢査	+	-	+
	種屬特異性病毒檢查	（+）	-	（+）
	牛源性病毒檢查	（+）	（+）	（+）
	豬源性病毒檢查	（+）	（+）	（+）
	其他特定病毒檢查	（+）	（+）	（+）

 

注：①表示生產(chǎn)終末細(xì)胞，是指在或超過生產(chǎn)末期時(shí)收獲的細(xì)胞，盡可能取按生產(chǎn)規(guī)模制備的生產(chǎn)末期細(xì)胞。“+ ”為必檢項(xiàng)目，“-”為非強(qiáng)制檢定項(xiàng)目。（+）表示需要根據(jù)細(xì)胞特性、傳代歷史、培養(yǎng)過程等情況要求的檢定項(xiàng)目。

 

由以上可知，對(duì)于各級(jí)細(xì)胞庫，我們應(yīng)該全面的梳理細(xì)胞的特性、培養(yǎng)歷史以及操作過程，然后對(duì)病毒安全性做出合理的評(píng)估和檢測(cè)。根據(jù)ICH Q5A的要求，應(yīng)對(duì)MCB進(jìn)行內(nèi)源性和非內(nèi)源性病毒污染的檢測(cè)；如果不檢測(cè)MCB，也可以使用WCB全面檢測(cè)進(jìn)行替代。另外，還要求對(duì)達(dá)到體外細(xì)胞傳代限次細(xì)胞進(jìn)行病毒檢測(cè)。根據(jù)中國(guó)藥典第三部（2015版）MCB需要進(jìn)行全面的檢測(cè)，并且要求對(duì)EOPC進(jìn)行檢定，而ICH法規(guī)規(guī)定在申報(bào)IND之前對(duì)EOPC檢定沒有要求。如果要進(jìn)行中外雙申報(bào)，建議依據(jù)中國(guó)法規(guī)進(jìn)行EOPC的檢定，并且對(duì)EOPC進(jìn)行與MCB檢定要求一致的檢定。

 

如果在細(xì)胞系構(gòu)建、細(xì)胞建庫過程或者生產(chǎn)過程中使用了動(dòng)物源成分，則需要開展有針對(duì)性的病毒檢測(cè)，如牛源性病毒和豬源性病毒檢測(cè)。對(duì)于牛源性病毒（牛血清等）來說，美國(guó)要求參照9CFR，涉及的病毒檢測(cè)包括BVDV,BAV5, BPV, BTV, BRSV, REO3, RV, IBR, PI3等病毒，而中國(guó)藥典要求檢測(cè)的病毒為BPI3, PI3, BAV-3, BPV, BVDV, REO3, RV等病毒。同樣，對(duì)于豬源性病毒（胰蛋白酶等），美國(guó)要求參照9CFR，需檢病毒為PPV,TGEV, PAV, REO3, HEV, BVDV, PI3, RV等病毒，而中國(guó)藥典沒有具體規(guī)定，需要根據(jù)具體情況來進(jìn)行評(píng)估和檢測(cè)。

 

另外，ICH規(guī)定：對(duì)于嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞系中的物種特異性病毒的檢測(cè)，可將被測(cè)試樣品接種到無病毒的動(dòng)物中去，經(jīng)一段特定時(shí)間后測(cè)定其血清抗體水平或酶活性。這種試驗(yàn)包括：小鼠抗體產(chǎn)生試驗(yàn)(MAP)、大鼠抗體產(chǎn)生試驗(yàn)(RAP)和倉鼠抗體產(chǎn)生試驗(yàn)(HAP)。而中國(guó)藥典第三部（2015版）也提及相關(guān)的試驗(yàn)，但是沒有提及具體檢測(cè)的病毒。在中國(guó)藥典（2020版）增加了“鼠源性病毒檢查法”，要求檢定8中鼠源性病毒，分別為淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、出血熱病毒、脫腳病病毒、仙臺(tái)病毒、小鼠肺炎病毒、III 型呼腸孤病毒、小鼠腺病毒、小鼠白血病病毒，這也可以作為我們進(jìn)行抗體產(chǎn)生試驗(yàn)的一個(gè)參考。事實(shí)上不同的動(dòng)物對(duì)不同的病毒靈敏度及反應(yīng)性不同，這是為什么法規(guī)會(huì)推薦多種動(dòng)物進(jìn)行抗體實(shí)驗(yàn)的原因。

 

ICH Q5A(R1)規(guī)定具體參加下表（表三）：

MAP	HAP	RAP
脫腳病病毒[2，3]	淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒[1，3]	漢坦(Hantaan)病毒[1，3]
漢坦病毒[1、3]	小鼠肺炎病毒(PVM)[2、3]	基爾漢姆（Kilham）大鼠病毒(KRV)[2、3]
K病毒[2]	呼腸病毒3型(Reo3)[1、3]	小鼠腦脊髓炎病毒 (泰累爾，GDVⅡ)[2]
乳酸脫氫酶病毒(LDM)[1、3]	仙臺(tái)(Sendai)病小鼠肺炎病毒[1，3]	小鼠肺炎病毒（PVM）[2，3]
淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(ICM)[1，3]	SV5	大鼠冠狀病毒(RCV)[2]
小鼠小病毒[2，3]	-	呼腸病毒3型（Reo3）[1，3]
小鼠腺病毒（MAV）[2、3]	-	仙臺(tái)病毒[1、3]
小鼠巨細(xì)胞病毒（MCMV）[2、3]	-	巨唾液腺炎病毒（SDQV）[2]
小鼠腦脊髓炎病毒(泰累爾，GDVⅡ)[2]	-	圖蘭(Toolm)病毒[2、3]
小鼠肝炎病毒（MHV）[2、3]	-	小鼠小輪狀病毒(EDIM)[2、3]
小鼠肺炎病毒(PVM)[2、3]	-	-
多瘤病毒[2]	-	-
呼腸病毒3型	-	-
(Reo3)[1、3]	-	-
仙臺(tái)病毒[1、3]	-	-
胸腺病毒[2]	-	-

 

注：1、有證據(jù)表明能感染人和靈長(zhǎng)目動(dòng)物的病毒；2、無證據(jù)表明能感染人的病毒；3、能在體外細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的來源于人或靈長(zhǎng)目動(dòng)物的病毒 

對(duì)生產(chǎn)工藝中清除病毒的能力進(jìn)行評(píng)估

（1）未經(jīng)處理的原液（UPB）病毒檢測(cè)

 

UPB包括集中回收的一批或多批細(xì)胞和培養(yǎng)基，如果存在病毒或病毒樣顆粒，其濃度是最為富集的，容易檢出。根據(jù) ICH Q5A 的建議，生物制品在進(jìn)行上市注冊(cè)申請(qǐng)時(shí)，至少應(yīng)上報(bào) 3 批中試生產(chǎn)或規(guī)?；a(chǎn)的未經(jīng)處理原液的病毒安全性研究資料?！渡锝M織提取制品和真核細(xì)胞表達(dá)制品的病毒安全性評(píng)價(jià)技術(shù)審評(píng)一般原則》要求在申報(bào)IND之前就應(yīng)該進(jìn)行3批中試生產(chǎn)或規(guī)?；a(chǎn)的未經(jīng)處理原液的病毒安全性研究。

 

在UPB病毒安全性評(píng)價(jià)時(shí)，一般使用多種細(xì)胞系進(jìn)行體外篩查試驗(yàn)；如適用，可使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 或其他適當(dāng)?shù)姆椒?。另外，ICHQ5A(R1)也要求對(duì)UPB需進(jìn)行電子顯微鏡檢測(cè)以檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄病毒的存在。

 

（2）生產(chǎn)工藝病毒去除/滅活的驗(yàn)證與研究

 

在生物制品的生產(chǎn)工藝步驟中要求設(shè)計(jì)病毒去除/滅活步驟，以對(duì)潛在的病毒污染風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行控制。并且，在開展人體臨床試驗(yàn)前，進(jìn)行初步的驗(yàn)證與研究，說明設(shè)置步驟的合理性和有效性。2019年6月27日，國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布了《生物制品病毒安全性控制公示稿》，這個(gè)藥品標(biāo)準(zhǔn)草案的公示無疑把生物制品的病毒清除/滅活的標(biāo)準(zhǔn)化提上日程。

 

進(jìn)行國(guó)外申報(bào)或者中外雙報(bào)，由于指導(dǎo)原則的不同必然造成國(guó)內(nèi)外申報(bào)存在一些差異（表四）。在IND申報(bào)時(shí)，中外在指示病毒選擇、工藝選擇以及重復(fù)性上差異較大；而在BLA申報(bào)時(shí)，中國(guó)國(guó)內(nèi)在指示病毒選擇和工藝選擇上會(huì)參照國(guó)外的指導(dǎo)原則和法規(guī)（ICH Q5A等），而重復(fù)性上要求三批次。

 

表四：國(guó)內(nèi)外申報(bào)病毒清除驗(yàn)證的差異比較

步驟	IND		BLA
	NMPA	EMA, TGA, FDA	NMPA	EMA, TGA, FDA
低pH	2種病毒（MULV, PRV），2批次，動(dòng)態(tài)曲線	1種病毒（MuLV），1批GMP批次，重復(fù)兩次	與FDA相同，只是需要3批次	2種病毒（MuLV, PRV），重復(fù)兩次
納濾	2種病毒（MVM, Reo-3），3 批次，流程內(nèi)的測(cè)試	2種病毒（MuLV, MVM），1批GMP批次，重復(fù)兩次，MVM需要流程內(nèi)測(cè)試	與FDA相同，只是需要3批次	4種病毒（MuLV, MVM, Reo-3, PRV），重復(fù)兩次，MVM需要流程內(nèi)測(cè)試
層析1	N/A	2種病毒（MuLV, MVM），1批GMP批次，重復(fù)兩次	與FDA相同，只是需要3批次	4種病毒（MuLV, MVM, Reo-3, PRV），重復(fù)兩次，評(píng)估樹脂的最大循環(huán)
層析2	N/A	另一個(gè)層析選擇	與FDA相同，只是需要3批次	4種病毒（MuLV, MVM, Reo-3, PRV），重復(fù)兩次，評(píng)估樹脂的最大循環(huán)

 

①指示病毒的差異

 

病毒清除研究中的一個(gè)主要問題是確定使用何種病毒。這些病毒可分為三類:“相關(guān)”病毒、特異“模型”病毒和非特異“模型”病毒。“相關(guān)”病毒是指用于生產(chǎn)過程中評(píng)價(jià)病毒清除情況的病毒，可以是已被鑒定的病毒，或是與已知病毒種類相同的病毒，或是可能會(huì)污染細(xì)胞培養(yǎng)物或污染生產(chǎn)過程中使用的其他試劑或材料的病毒。如果得不到“相關(guān)”病毒，或它不太適用于清除病毒的工藝評(píng)價(jià)研究(如不能離體培養(yǎng)到足夠的滴度)，應(yīng)使用特異“模型”病毒代替。

 

國(guó)外法規(guī)雖沒有做出具體的要求，但是要求盡可能選擇污染產(chǎn)品最相似的病毒進(jìn)行驗(yàn)證，即特異性指示病毒；同時(shí)也需要關(guān)注具有廣泛理化性質(zhì)的非特異性病毒。

 

而中國(guó)的病毒安全性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則要求比較詳細(xì)具體，明確指出了清除驗(yàn)證中所應(yīng)使用病毒的類型。法規(guī)要求：“一個(gè)典型的驗(yàn)證研究所選擇的病毒，至少應(yīng)包括單鏈和雙鏈的RNA及DNA、脂包膜和非脂包膜、強(qiáng)和弱抵抗力、大和小顆粒等病毒；去除/滅活技術(shù)方面可根據(jù)采用的具體方法選擇恰當(dāng)?shù)倪m宜病毒。”

 

當(dāng)然，關(guān)于如何指示病毒的核心需要以在整個(gè)生產(chǎn)過程中可能出現(xiàn)的污染病毒為主，并且結(jié)合能夠用于評(píng)價(jià)驗(yàn)證效果的指示病毒的可獲得性與相關(guān)培養(yǎng)試驗(yàn)條件進(jìn)行合理設(shè)計(jì)。

 

②工藝選擇差異，效果要求略有不同

 

根據(jù)表四可知，中國(guó)國(guó)內(nèi)IND申報(bào)時(shí)，一般選擇低pH（或者有機(jī)溶劑/去污劑(S/D)）和膜過濾這兩個(gè)工藝。國(guó)外進(jìn)行IND申報(bào)時(shí)，除了選擇以上這兩個(gè)工藝外，還需加一個(gè)層析工藝（如果還是達(dá)不到要求，還需再加一步層析）。

 

生物制品工藝驗(yàn)證與研究中，需要針對(duì)以上對(duì)病毒具有去除或滅活效果的純化步驟進(jìn)行充分的驗(yàn)證，根據(jù)研究的結(jié)果評(píng)價(jià)整體工藝對(duì)病毒安全性的防控效果。

 

③重復(fù)性差異

 

中國(guó)國(guó)內(nèi)的指導(dǎo)原則雖然沒有硬性的規(guī)定，但通常需要做三個(gè)批次（GMP或non-GMP都可以）。在ICH法規(guī)中，明確指出至少分別做兩次獨(dú)立的研究來證實(shí)清除的可重復(fù)性，因此一般是一批樣品（一般要求GMP）重復(fù)兩次。

 

總結(jié)與討論

 

病毒安全性評(píng)價(jià)是生物制品生產(chǎn)中的一項(xiàng)重要的研究項(xiàng)目。病毒安全性評(píng)價(jià)包括病毒檢測(cè)和病毒滅活/去除兩大塊項(xiàng)目，其中病毒檢測(cè)包括細(xì)胞庫（PCB/MCB/WCB/EOPC）病毒檢定和UPB病毒檢測(cè)。關(guān)于病毒安全性評(píng)估，每個(gè)國(guó)家都有自己相關(guān)的法規(guī)和指導(dǎo)原則。由于這種原因使得我們國(guó)內(nèi)的很多生物制藥企業(yè)對(duì)于國(guó)外申報(bào)或者中外申報(bào)“望而卻步”。

由于病毒安全性評(píng)價(jià)各國(guó)所參照的法規(guī)不一致，其關(guān)于細(xì)胞庫檢定中病毒檢測(cè)方面，可以看出中外申報(bào)雖然各方面檢測(cè)要求比較一致，但是還是有差異的。例如，在牛源性病毒和豬源性病毒方面，所參照的法規(guī)不一致，所要檢測(cè)的病毒也不一致；在抗體產(chǎn)生試驗(yàn)檢測(cè)部分，所要檢測(cè)的病毒也是不一致的；在細(xì)胞庫檢定類型方面，國(guó)外IND申報(bào)不要求對(duì)EOPC進(jìn)行檢定。在病毒清除研究方面中外申報(bào)的要求也是存在許多不同的，包括指示病毒選擇、工藝步驟選擇以及重復(fù)性方面。

隨著中國(guó)加入并成為ICH管理委員會(huì)成員，NMPA的法規(guī)逐漸與ICH接軌，技術(shù)指導(dǎo)原則等也越來越向其靠攏。2020年1月21日NMPA發(fā)出公告，自2020年7月10日開始的國(guó)內(nèi)申報(bào)材料中藥學(xué)研究部分關(guān)于病毒安全性評(píng)價(jià)及方法驗(yàn)證，適用于ICH Q5A(R1)和ICHQ5B指導(dǎo)原則。這也就是說，在2020年7月10日之后，我們?nèi)绻枰M(jìn)行中外申報(bào)可以按照國(guó)際申報(bào)的要求，尋求遵循GMP的合格第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)來進(jìn)行相關(guān)的研究。按照國(guó)外申報(bào)要求進(jìn)行細(xì)胞庫病毒檢測(cè)，在國(guó)內(nèi)申報(bào)也是可行的；并且在以后的病毒清除研究中，我們也許可以真正的只采用一批GMP批次并按照國(guó)際申報(bào)的要求進(jìn)行研究，就可以滿足中外雙報(bào)的要求。這無疑是給我們國(guó)內(nèi)的生物制藥企業(yè)打了一針“強(qiáng)心劑”，使越來越多制藥企業(yè)選擇中美雙報(bào)或多國(guó)多報(bào)，從而加速藥品上市。

 

后記

 

病毒安全性評(píng)價(jià)是生物制品生產(chǎn)過程中極其重要的一項(xiàng)，在生物制品細(xì)胞庫建立和生產(chǎn)工藝?yán)飸?yīng)該重點(diǎn)考慮和設(shè)計(jì)的步驟。但是由于各國(guó)相關(guān)的指導(dǎo)原則和法規(guī)的不同，導(dǎo)致了國(guó)內(nèi)許多中外雙報(bào)的生物制藥企業(yè)在病毒安全性評(píng)價(jià)方面尋找不到合格的服務(wù)供應(yīng)商。中國(guó)NMPA公告開始適用于ICH法規(guī)（ICH Q5A和ICH Q5B），這也明示這按照國(guó)外申報(bào)的要求進(jìn)行研究也是符合中國(guó)國(guó)內(nèi)的申報(bào)要求。