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類比與RT-qPCR實驗，Westen blot實驗是從蛋白水平檢測基因的表達情況，而在檢測過程中內(nèi)參基因的表達是相對恒定的，因此我們在探究目的基因受實驗處理影響表達時需要挑選適合的目的基因作為內(nèi)參，再進一步與實驗對照組比較目的基因的相對表達量。

目前在實驗中比較常用的內(nèi)參基因主要為GAPDH（36KDa）、β-actin（42KDa）、β-tubulin（50-55KDa）。

（1）GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）

GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是在細胞代謝糖酵解中起關(guān)鍵作用的酶，由4個30-40kDa的亞基組成，檢測條帶大約在36kDa，通常表達量較高，在相同的細胞或組織中的表達量比較恒定。但是在缺氧和糖尿病等疾病情況中，GAPDH表達可能會發(fā)生變化，因此在這些情況下不推薦作為內(nèi)參。

（2）Actin（肌動蛋白）

Actin是構(gòu)成細胞骨架的主要蛋白之一。最常用作內(nèi)參蛋白的是β-actin，檢測條帶大約在分子量42kDa。在許多真核細胞中都有廣泛且穩(wěn)定的表達，適用于全細胞和細胞質(zhì)樣品。

（3）Tubulin（微管蛋白）

Tubulin是構(gòu)成微管網(wǎng)絡(luò)的重要蛋白。最常用作內(nèi)參蛋白的是β-tubulin，檢測條帶大約在55 kDa。微管蛋白與維持細胞形態(tài)和分裂過程有關(guān)，因此它的表達水平可能受細胞狀態(tài)變化的影響?？股睾涂褂薪z分裂耐藥的細胞，Tubulin微管蛋白表達可能存在差異，即耐藥性研究可能不建議用Tubulin作為內(nèi)參蛋白。

在保證上樣量一致的情況下，相對于對照組，實驗組目的蛋白的表達水平是否有差異。挑選原則如下：

1、針對樣本而言

首先考慮樣品的物種來源、目的蛋白的表達部位例如全細胞、細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜或者血清 、血漿樣本等。一般地，哺乳動物的細胞或者組織樣本選擇GAPDH、actin、tubulin（全細胞）、ATP1A1（細胞膜蛋白）、Histone H3（核蛋白）、Lamin（細胞核摸）、COX412（線粒體）、Albumin（全血、血漿、血清）作內(nèi)參。而一些稀有物種具體需要通過查閱文獻選擇比較保守的管家基因作為蛋白內(nèi)參。

2、蛋白分子量選擇

（1）原則上選擇的內(nèi)參與通常應(yīng)該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5 KDa以上

例如PTEN(47-55KDa)，此時內(nèi)參選擇GAPDH比較合適，NF-κb（65-70KDa）,此時β-actin較合適，GAPDH也可以；另外若是分子量為42-45kDa，此時不適宜選擇β-actin 作為內(nèi)參，可以考慮選擇GAPDH或β-tubulin作為內(nèi)參。另外兩種內(nèi)參也是相同情況。

（2）內(nèi)參和目的蛋白也不是相差越大越好

1）轉(zhuǎn)膜時間不好控制，若內(nèi)參太小，目的蛋白太大，會導(dǎo)致內(nèi)參轉(zhuǎn)膜過度或者目的蛋白未完全轉(zhuǎn)上。此情況需要分開轉(zhuǎn)膜。

2）保證穩(wěn)定性，內(nèi)參蛋白需要在不同樣本中穩(wěn)定表達，以確保實驗結(jié)果的可靠性。如果內(nèi)參蛋白的表達水平與目的蛋白相差過大，可能會對目的蛋白的檢測產(chǎn)生干擾。

3）另外若是同時處理多個樣本，將目的蛋白和內(nèi)參分開進行檢測可以同時處理多個樣本，提高實驗效率。如果內(nèi)參和目的蛋白的表達水平相差過大，可能需要調(diào)整上樣量和抗體濃度，這可能會降低實驗效率。

3、細胞 、組織特異性

在選擇內(nèi)參時，在考量實驗條件和研究背景下，不同的細胞類型和實驗?zāi)康目赡苄枰煌膬?nèi)參。例如我們在做多細胞、多組織樣本或者動物實驗樣本對比表達量時，GAPDH作為內(nèi)參是比較合適，因為GAPDH作為細胞代謝過程中 關(guān)鍵酶類蛋白，在組織中表達比較恒定。而β-Actin和β-Tubulin是細胞骨架成分的 結(jié)構(gòu)蛋白，不同組織的細胞結(jié)構(gòu)會有差異性。

4、內(nèi)參帶條齊、目的蛋白有趨勢

基本前提：（1）內(nèi)參選擇正確（2）上樣量一致

注意事項：目前我們在進行Westen blot實驗室傾向于裁剪NC膜或者PVDF以減少整膜孵育抗體和洗膜的麻煩。根據(jù)經(jīng)驗來看，內(nèi)參抗體和目的蛋白抗體的蛋白分子量可能處于一個區(qū)間并不是一個準確的位置，即存在理論位置和實際觀察位置 ，在閱讀抗體說明書時我們一般會使用抗體的實際觀察位置，否則就會因裁膜不當造成條帶不全，或者條帶位置不正確。但是近些年許多雜志都要求整膜不允許裁膜，所以在裁膜孵育抗體必須考慮清楚。