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關(guān)節(jié)內(nèi)給藥（Intra-articular, IA）可以直接靶向關(guān)節(jié)，用于治療多種關(guān)節(jié)?。ㄈ绻顷P(guān)節(jié)炎、物理創(chuàng)傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎或假性痛風(fēng)）。IA給藥能最大限度的提高療效并減少毒性。當(dāng)然，這種給藥方式也有缺點，需要由一位經(jīng)驗豐富、技術(shù)熟練的人給藥，不僅可以避免醫(yī)源性損傷、出血或感染，還可以將目標(biāo)劑量藥物準(zhǔn)確遞送到正確的位置。

解剖特點

不同動物種屬的關(guān)節(jié)解剖特征與人體是非常相似的。膝關(guān)節(jié)是人體最大的滑膜關(guān)節(jié)，臨床上最為多見，也相對容易操作，是本文討論的重點。當(dāng)然，理論上所有關(guān)節(jié)都是可以注射的。膝關(guān)節(jié)空間比較大，注射后的藥物可以充分分布。滑膜表面和隱窩向上延伸至股骨兩側(cè)，向下延伸至脛骨兩側(cè)。在關(guān)節(jié)的十字韌帶連接處經(jīng)常有一些區(qū)域（含微腔和不平整結(jié)構(gòu)），類似囊樣凹槽，會積聚滑液和注射物，并在股骨-脛骨和股骨-髕關(guān)節(jié)空間內(nèi)自由流動。在正常動物中，滑液會薄薄地覆蓋各個表面，但不會填充整個關(guān)節(jié)空間。當(dāng)出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎時，滑液體積增加，可以填充大部分空間，通常會腫脹。

已有多種方法用于評估軟骨和滑膜表面積，如下表所示。

毒理試驗種屬選擇

首先在毒理試驗之前，通常會開展關(guān)節(jié)內(nèi)給藥的藥效學(xué)研究。除了鎮(zhèn)痛適應(yīng)癥以外，大部分關(guān)節(jié)用藥藥物的有效性終點會涉及組織病理學(xué)檢查。通過藥效學(xué)動物模型，可以為毒理試驗種屬選擇提供很多信息。比如骨關(guān)節(jié)炎模型主要分為兩種，一種是手術(shù)造模，如半月板損傷模型（meniscal destabilization, DMM）、前交叉韌帶橫斷模型（nterior cruciate ligament transection, ACLT）、內(nèi)側(cè)半月板撕裂模型。另外一種是化學(xué)試劑造模，如單碘乙酸鹽造模、單鈉尿酸鹽晶體造模等。這些模型在小鼠中應(yīng)用很廣泛，也很常見。雖然給藥會有些挑戰(zhàn)，但也是可以實現(xiàn)關(guān)節(jié)內(nèi)給藥。其實將小鼠作為藥效學(xué)和毒理研究種屬的主要挑戰(zhàn)還有幾點，一是小鼠有自發(fā)的內(nèi)側(cè)軟骨退化情況，且隨著年齡增長，還會加劇。二是小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射有引起交叉韌帶損傷的趨勢，有點類似ACLT。另外，小鼠的關(guān)節(jié)內(nèi)注射劑量要控制，避免引起關(guān)節(jié)腫脹。最后，在小鼠中監(jiān)測關(guān)節(jié)腫脹和疼痛比大動物種屬更具挑戰(zhàn)。

大鼠也是骨關(guān)節(jié)炎模型的常用種屬。小鼠中的模型幾乎在大鼠中均能實現(xiàn)。而且大鼠沒有小鼠的年齡相關(guān)的內(nèi)側(cè)軟骨退化問題。選擇大鼠的一個挑戰(zhàn)的是，大鼠有比較高的軟骨囊腫情況，尤其在關(guān)節(jié)外側(cè)。不過，這一自發(fā)性變化比較容易鑒別，所以影響有限。而且，大鼠經(jīng)關(guān)節(jié)內(nèi)給藥后的臨床毒性評估，如膝蓋腫脹、步態(tài)異常等，也很容易實現(xiàn)。

與大鼠和小鼠類似，豚鼠也可以通過很多手術(shù)、化學(xué)試劑制備關(guān)節(jié)疾病模型。不過，豚鼠存在的問題是該種屬從3個月開始出現(xiàn)自發(fā)性的膝蓋骨關(guān)節(jié)炎，并在12-18個月進(jìn)展到嚴(yán)重的程度。這種情況的存在，可能會使關(guān)節(jié)內(nèi)給藥毒性結(jié)果的評估復(fù)雜化。

兔關(guān)節(jié)內(nèi)空間大，沒有自發(fā)軟骨退化問題，也是個理想的動物種屬。唯一有些挑戰(zhàn)的是兔久坐和比較特別的步態(tài)（跳躍），可能對疼痛和腫脹的檢測帶來一些困難。相比之下，比格犬更為理想，關(guān)節(jié)空間大，沒有自發(fā)軟骨退化，毒理終點如腫脹和步態(tài)也很方便評估。當(dāng)然，猴也是常用非嚙齒類種屬。不過，猴存在軟骨囊腫和自發(fā)脛骨內(nèi)側(cè)軟骨退化問題。

總體來看，大鼠和犬是比較理想的關(guān)節(jié)內(nèi)給藥種屬，容易操作，關(guān)節(jié)內(nèi)給藥體積能滿足常規(guī)要求，幾乎沒有自發(fā)軟骨退化出現(xiàn)，不會使毒理學(xué)結(jié)果的解釋復(fù)雜化，而且這兩個種屬的毒理終點評估如腫脹、步態(tài)異常，也很容易實現(xiàn)。不過，這只是從膝關(guān)節(jié)解剖和病理生理學(xué)特點進(jìn)行的考量。常規(guī)相關(guān)種屬確定路徑，如生物藥與不同種屬的靶點結(jié)合和活性等也需要評估。不過，如果在該種屬中已經(jīng)能做出藥效，說明具備體內(nèi)活性，自然也應(yīng)該是相關(guān)動物種屬。

關(guān)節(jié)內(nèi)藥物遞送

關(guān)節(jié)內(nèi)給藥屬于非常規(guī)給藥方式，動物需要麻醉，以避免動物意外活動造成損傷。給藥用的針頭規(guī)格應(yīng)盡可能小，盡可能短，避免對關(guān)節(jié)造成創(chuàng)傷。給藥體積應(yīng)根據(jù)動物關(guān)節(jié)大小進(jìn)行調(diào)整（見前文表格），避免出現(xiàn)體積過大，關(guān)節(jié)過度擴(kuò)張，引發(fā)炎癥或刺激，而且還可能會導(dǎo)致藥物清除加快。還要注意不要將針插入關(guān)節(jié)后部太遠(yuǎn)，這可能會碰到膝蓋后部的腘動脈并導(dǎo)致出血。

關(guān)節(jié)內(nèi)給藥的毒理終點評估

應(yīng)在給藥后24h內(nèi)觀察關(guān)節(jié)腫脹情況，并根據(jù)嚴(yán)重程度適當(dāng)延長觀察周期。大鼠可以用卡尺直接測量膝關(guān)節(jié)腫脹程度。犬則可以借助繩索繞膝關(guān)節(jié)一周，然后測量繩索長度變化。如果確實觀察到腫脹，擬進(jìn)一步考察疼痛程度，可以通過測力板考察站立疼痛，通過步態(tài)分析考察移動疼痛。

與其他藥物類似，組織病理學(xué)檢查也是關(guān)節(jié)內(nèi)給藥藥物毒理學(xué)評價的核心指標(biāo)。尤其是對一些不可逆變化的指標(biāo)考察，比如膠原基質(zhì)損失和軟骨細(xì)胞的死亡。軟骨細(xì)胞死亡的原因通常有兩種，一種是藥物的直接毒性，一種是中性粒細(xì)胞引起的炎癥導(dǎo)致的。一旦發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞死亡，是需要明確原因的。因為，如果是炎癥原因所致，可以通過改變?nèi)苊交蛘哒{(diào)整操作改善。如果是藥物直接毒性，那就沒有辦法了。除了不可逆變化，有些毒性發(fā)現(xiàn)是可逆性的。即使關(guān)節(jié)內(nèi)注射生理鹽水，也會出現(xiàn)諸如輕微的急性滑膜炎和軟骨的蛋白聚糖損失。不過，這些毒性在注射一段時間后，可以完全恢復(fù)。還有些長時間釋放藥物（比如一些緩釋和控釋制劑）的顆粒物通常會滯留在滑膜中，引起一些慢性炎癥，當(dāng)這些物質(zhì)被巨噬細(xì)胞處理/清除后，炎癥會消退。

關(guān)節(jié)內(nèi)給藥毒理研究的其他常規(guī)考量

除了前文提及的給藥體積問題，還需要注意給藥間隔，即頻率問題。很多關(guān)節(jié)內(nèi)給藥制劑粘度比較高（如透明質(zhì)酸），需要給關(guān)節(jié)留出足夠時間清除這些物質(zhì)。高粘性物質(zhì)聚積會引起嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎和軟骨細(xì)胞死亡/關(guān)節(jié)內(nèi)基質(zhì)破壞。如果在下次注射前，這些物質(zhì)已被充分清除，可以減少這類問題的出現(xiàn)。不同產(chǎn)品在關(guān)節(jié)內(nèi)滯留時間不等，從數(shù)分鐘到幾個月的情況都有，需要根據(jù)實際檢測情況確定。

動物年齡也很關(guān)鍵。具有閉合關(guān)節(jié)/骨骺生長板的成熟動物，與不成熟動物相比，軟骨對一些損傷的反應(yīng)是不同的。大鼠約11周，犬約7個月，達(dá)到與成年人一樣的成熟程度。

建議始終使用冠狀面組織切片（而不是矢狀面）進(jìn)行組織病理學(xué)評估。因為動物膝蓋兩側(cè)的承重是有差異的，會影響病變的發(fā)展，一些自發(fā)變化往往發(fā)生在其中一側(cè)。冠狀面切片可以準(zhǔn)確識別關(guān)節(jié)的內(nèi)側(cè)和外側(cè)區(qū)域，以便對誘發(fā)和自發(fā)損傷進(jìn)行詳細(xì)評估。例如，關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)的更多承重可能會導(dǎo)致與彌漫性炎癥變化相關(guān)的更大面積軟骨細(xì)胞死亡（內(nèi)側(cè)），而且承重差異通常會導(dǎo)致優(yōu)先承重側(cè)的軟骨下骨增加。另外，毒理研究設(shè)計應(yīng)具有足夠的持續(xù)時間，以確定軟骨細(xì)胞死亡是單次或多次給藥導(dǎo)致的。關(guān)節(jié)病理切片染色方面，甲苯胺藍(lán)等陽離子染料染色比標(biāo)準(zhǔn)的蘇木精和伊紅（H&E）染色更有用。陽離子染料與軟骨基質(zhì)中帶負(fù)電荷的蛋白多糖結(jié)合，從而更有助于識別蛋白多糖減少的區(qū)域。有助于病理學(xué)家識別早期軟骨細(xì)胞死亡的區(qū)域，因為當(dāng)軟骨細(xì)胞死亡時，蛋白多糖會隨著時間的推移而丟失（起初是輕微的，然后是永久的、嚴(yán)重的）。使用甲苯胺藍(lán)染色可以很容易地觀察到炎性細(xì)胞浸潤、滑膜纖維化、軟骨下骨吸收和絕大多數(shù)其他對關(guān)節(jié)病理評估很重要的變化。

最后，再強(qiáng)調(diào)一下關(guān)節(jié)內(nèi)不可逆變化如軟骨細(xì)胞死亡考察的重要性。關(guān)節(jié)內(nèi)給藥需要找到出現(xiàn)這一變化的安全邊界，或者是找到治療窗口。如果可以，能收集到滑膜液藥物濃度最好。如果不行，可以通過固定給藥體積，增加給藥濃度，探索這一邊界。如果藥物溶解度有限，不能實現(xiàn)濃度在一定范圍的變化，也可以考慮固定濃度，增加給藥體積，但體積一定要在前文表格中限定的合理范圍之內(nèi)。也可以結(jié)合動物藥效研究數(shù)據(jù)，確定藥物的安全窗口。