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在生物體中，各種3D微觀結構具有不同的功能，包括應對威脅時減輕損傷、加速營養(yǎng)的合成和運輸以及促進細胞生長和繁殖調節(jié)。這些微觀結構在生物體的生存和發(fā)展中起著關鍵且不可替代的作用。骨骼是人體的主要支撐結構，具有兩個獨特的屬性：剛性，提供全身支撐；韌性，保護內(nèi)臟免受外部沖擊。在大多數(shù)材料中，這兩種屬性通常是相互排斥的。因此，骨組織的獨特的3D微觀結構在使其同時表現(xiàn)出剛性和韌性方面起到了重要作用。盡管骨組織具有自然再生能力來愈合裂縫和某些類型的骨折，但超過臨界大小閾值的骨缺損（每年約有四百萬患者需要接受臨界骨缺損修復手術）在沒有干預的情況下不會愈合。在臨床環(huán)境中，由于先天性異常、創(chuàng)傷、動脈瘤和癌癥導致的臨界大骨缺損的最常見的治療方法是自體骨移植，這伴隨著自體骨的大小和形狀不匹配、骨吸收和繼發(fā)性疾病等挑戰(zhàn)。3D打印支架能夠有效解決不規(guī)則形狀的問題，通過結合表面設計，可以改善骨整合并最小化感染風險。因此，開發(fā)模仿天然骨微觀結構的生物替代品以修復臨界大小的骨缺損并重新建立自然骨功能至關重要。

來自上海交通大學的金學軍等團隊提出了一種用于3D打印支架的分形仿生設計，該設計結合了3D打印和高能等離子鉭合金制造技術，使其在工業(yè)規(guī)模上易于生產(chǎn)。分形仿生設計利用了分形幾何的原理，采用自相似模式和隨機分形，以實現(xiàn)3D支架上的自相似表面設計。這種方法旨在緊密模仿自然骨結構中觀察到的分形維數(shù)。雖然植入物的表面粗糙度在恢復結果中起著關鍵作用，但這一發(fā)現(xiàn)表明，納入表面的分形維度可能比單純的粗糙度更為重要。使用大鼠顱骨缺損模型來評估三種支架的成骨潛力，并首次采用光聲技術對骨修復過程中的生理信號進行長期、原位監(jiān)測。細胞實驗和動物實驗的結果均表明，分形仿生支架相對于表面改性支架和3D打印支架具有顯著優(yōu)勢。實驗結果顯示，仿生支架組表現(xiàn)出更好的促進骨生成的過程。相關工作以題為“A Fractal-Like Hierarchical Bionic Scaffold for Osseointegration”的文章發(fā)表在2025年01月07日的期刊《Advanced Functional Materials》。    

【仿生設計支架規(guī)則與隨機分形在骨組織（理化與幾何）】

圖1展示了促進骨生長的仿生支架設計策略的核心概念。本文在仿生支架的制造過程中創(chuàng)建了一個高能量等離子云環(huán)境（圖1A）。通過施加電壓、電流、高溫和離子轟擊，支架表面表現(xiàn)出自優(yōu)化行為，隨后形成了層級組織結構。本文考慮了幾何結構對多尺度骨修復的影響，不僅僅在單一維度上，因為骨組織本質上具有層級組織結構。因此，對于骨組織的修復，本文專注于仿生的微環(huán)境，包括幾何形狀以及物理和化學性質。細胞對微環(huán)境的幾何特征——包括凹槽、脊和孔洞，從納米到毫米不等的尺度——的反應方式已經(jīng)研究了幾十年。普遍認為，更合適的表面粗糙度可以增強骨組織的恢復。本文設計的仿生支架的表面粗糙度與實際頭骨顯著不同（圖1E），但結果表明，仿生支架的成骨性能優(yōu)于表面粗糙度接近自然骨的支架。分形維數(shù)可能比表面粗糙度更適合描述支架表面的生物學效應。本文在納米尺度上基于大鼠自然頭骨中發(fā)現(xiàn)的幾何形狀開發(fā)了仿生支架，主要關注復制自然的自仿射結構（圖1B）。這種多層次自下而上的仿生設計使得支架更加類似于真實的骨結構。除了這些規(guī)則的自仿射形狀外，骨骼還有更多的隨機形狀。目前骨修復支架的表面設計主要依賴于均勻的周期性結構，例如納米管。對于其他不規(guī)則或非均勻表面的支架，例如水凝膠，沒有確定的定量方法來描述其表面形態(tài)，相關結論仍然未被充分探索。    

為了彌補這一空白，本文引入了分形維數(shù)的概念來定量描述骨表面的隨機結構，這些結構在固定尺度（例如微米和納米）上表現(xiàn)出隨機結構以及分形自仿射架構。本文的研究從兩個角度描述了分形仿生支架：分形維數(shù)和表面孔隙相似性?？紫督Y構的相似性如圖1B所示，并在多個尺度上進行了可視化展示。對于分形維數(shù)，本文計算并比較了實驗支架組、自然骨和仿生支架組之間的值。結果表明，仿生支架與自然骨之間的分形維數(shù)沒有統(tǒng)計學上的顯著差異（圖1D）。這些發(fā)現(xiàn)強調了本文的分形仿生支架成功地復制了骨孔形態(tài)的相似性和自然骨表面的維度特征，為支架設計提供了一種新穎的方法。骨表面的分形維數(shù)與仿生支架沒有顯著差異，但與其他兩種支架顯著不同（圖1D）。這兩種幾何結構的組合使得支架表面更像真實骨的表面地形，本文預期它將產(chǎn)生更有效的骨修復效果。

圖1 基于規(guī)則形狀和高分形維數(shù)的骨組織3D支架表面設計

微環(huán)境中增強骨修復的另一個關鍵方面包括支架表面的物理化學性質。為了改善表面的性質，主要利用高溫和高密度等離子云的作用，使表面主要由鈦鉭合金組成。這種合金為骨修復提供了比3D打印的鈦合金（Ti6Al4V）更有利的化學環(huán)境。首先，仿生支架表面形成的單一均勻鈦鉭結構可以顯著減少TC4中可能影響人體長期植入的鋁和釩的沉淀問題，從而確保支架的安全性。許多研究表明，接近真實骨的彈性模量可以顯著減少“應力屏蔽”效應，從而改善骨恢復。仿生支架的彈性模量為≈22 GPa，與骨骼皮質骨的彈性模量（16.6至25.7 GPa）一致（圖2B）。通過聚焦離子束（FIB）銑削，本文獲得了三種支架的表面微觀結構（圖2D-G）。3D打印支架的雙相結構消失，表面改性支架上出現(xiàn)了明顯的馬氏體條狀結構，其主要晶體結構由α和β相組成。圖2E顯示了表面改性支架中元素的明顯分離。這種分離表明支架表面微觀區(qū)域的性能有所降低。仿生支架的TEM結果表明，其復雜的相被擠壓到最外層（大多數(shù)區(qū)域顯示出均勻的單bcc結構），EDS結果表明，在大多數(shù)區(qū)域沒有元素分離（圖2F,G）。本文認為這三種結構的顯著差異首先導致了模量的變化，其次，均勻的仿生支架和表面改性支架在納米壓痕測試中表現(xiàn)出超彈性特性（圖2A）。仿生支架顯示出更長且更平滑的平臺，表明其超彈性質量高于其他兩種支架表面。    

圖2 對三種支架樣品（3D打印支架、表面改性支架和仿生支架）的機械性能和微觀結構進行評估    

【通過光聲技術原位評估仿生3D打印支架的骨再生】

關鍵尺寸顱骨的修復和功能恢復是一個多因素過程，包括各種生理、電和機械信號的變化，這些信號的變化表明了修復區(qū)域的狀況。長期原位監(jiān)測這些信號有助于跟蹤骨修復過程并確定修復的關鍵時間點；此外，它還可以作為評估仿生支架性能的指標之一。光聲斷層掃描（PAT）可以在骨修復過程中，提供小鼠大腦不同長度尺度上的結構、血液氧合和流動動態(tài)信息；不同的組織和材料具有不同的特定吸收范圍，這可以有效減少特定波長下的背景干擾。在第一周（具體是手術后第四天），原位觀察了大鼠的骨缺損區(qū)域，并注意到受傷部位周圍有大量的血流，除了在3D打印支架上以外（圖3A–C）。血管信號主要集中在支架下方，因此推測顱骨修復是從基部向大腦皮層進行的。與第二周的血管數(shù)據(jù)相比，仿生支架的血流信號顯著增強，逐漸覆蓋整個支架。在第四周，仿生支架的信號更為集中，這表明仿生支架具有促進支架內(nèi)血管生長的效果。到了第12周，仿生支架的血管信號減弱到低點（圖3F）。相比之下，3D打印支架的血管信號顯著增加，其血管面積明顯低于仿生支架（圖3D）。值得注意的是，所有三種支架在支架內(nèi)部都接收到血管信號。在第一周，3D打印支架中的血氧和血紅蛋白區(qū)域不連續(xù)，而仿生支架和表面修飾支架的信號區(qū)域則更加連續(xù)。這表明仿生支架的表面促進了細胞修復。  

圖3 支架植入后第一周和第十二周內(nèi)，對大鼠顱骨缺損區(qū)域的血氧飽和度/總血紅蛋白（HBT）、光聲成像以及血流進行原位觀察

骨生成和血管生成是決定骨修復成功與否的兩個關鍵因素，內(nèi)部血管的發(fā)展對于骨再生的成功至關重要。如圖4A所示，骨修復所需的營養(yǎng)物質、細胞代謝所需的氧氣以及促進修復的各種細胞并不是在骨缺損內(nèi)合成的；它們必須通過血管運輸?shù)绞苡绊懙膮^(qū)域，然后由血管移除細胞產(chǎn)生的廢物。PAT可以在骨修復過程中捕捉血液供應的變化，并通過量化不同區(qū)域的血紅蛋白氧飽和度（SO2）來評估骨缺損區(qū)域內(nèi)的營養(yǎng)交換和細胞分布及遷移。本文觀察到血管面積和HBT呈現(xiàn)出類似的波形趨勢，其中仿生支架的變化最為顯著（圖4A,B）。與其他兩種支架相比，仿生支架出現(xiàn)得更早且峰值更高。血流面積和HBT的峰值出現(xiàn)時間比表面仿生支架快兩倍，比3D打印支架快六倍以上。本文認為這提供了由于仿生支架表面的分形設計和理化性質而加速修復的證據(jù)。此外，表面修飾支架相對于3D打印支架也顯示出顯著更快的修復速度，這表明支架表面微環(huán)境的變化可以顯著影響骨修復的速度。就峰值而言，仿生支架的HBT峰值數(shù)量顯著高于其他兩種支架。這是因為仿生支架能夠有效增強缺損部位的細胞活性，從而促進缺損修復。雖然仿生支架和表面修飾支架的血流面積之間沒有顯著差異，但它們都是3D打印支架的四倍。本文認為這可能是由于局部受損區(qū)域生成的血管總數(shù)有限，而這兩種支架都能促進血管生長。因此，監(jiān)測支架的光聲信號變化可以作為評估缺損部位骨修復各階段的輔助工具。    

圖4 支架植入后12周內(nèi)的血氧飽和度（SO2）/總血紅蛋白（HBT）、光聲成像和血流的原位觀察結果

【仿生3D打印支架的骨再生效果的體外和體內(nèi)評估】

本文通過體內(nèi)和體外實驗來確認仿生支架的成骨特性。在每只大鼠的頭骨上創(chuàng)建了直徑為5毫米的標準顱骨缺損模型（組數(shù)=10），并在受控環(huán)境中飼養(yǎng)了12周。在死亡之前，沒有觀察到任何實驗動物出現(xiàn)嚴重的感染跡象。CT圖像也描繪了骨形成的趨勢（圖5A，B）。與其他兩種支架相比，仿生支架表現(xiàn)出更快的骨形成速度和更多的骨形成量。此外，值得注意的是，微CT圖像結果與光聲圖像一致。與血管信號的方向一致，微CT結果還表明初始骨形成部位位于支架下方。對于仿生支架，骨形成的最顯著變化發(fā)生在4-8周，這與HBT最快速下降的時期相吻合。體外細胞實驗顯示仿生支架具有良好的細胞相容性（圖5C），圖5D展示了在支架上培養(yǎng)的BMSCs的共聚焦熒光圖像。SEM圖像顯示BMSCs進入了3D多孔結構，并很好地附著在表面和仿生支架上。此外，BMSCs在表面上呈現(xiàn)出良好的伸展、拉長和典型的紡錘形形態(tài)，并且ALP結果表明3D仿生支架提供了適合細胞附著和生長的理想微環(huán)境。在添加成骨補充劑培養(yǎng)14天后，進一步評估了成骨基因的表達和Western-blot結果，以研究仿生表面對基因表達的影響（圖5E，F(xiàn)）。當相對表達進行半定量分析時，發(fā)現(xiàn)仿生組中的成骨基因上調，相比于其他支架。這些結果表明，仿生支架上的許多基因表達是其他三組的三倍。    

圖5 三種支架在體外和體內(nèi)的恢復能力

【總結與展望】

本文在此提出了一種創(chuàng)新的方法，稱為分形仿生設計策略，旨在利用骨的分形結構和幾何特征來增強傳統(tǒng)支架的表面特性，本文的總目標是增強支架促進骨修復和血管生成的能力。通過使表面與自然頭骨表面的分形維度和輪廓對齊，并調整內(nèi)部微觀結構，這一策略產(chǎn)生了一種低模量、超彈性的鈦-鉭合金，具有單一的bcc晶體結構。因此，彈性模量顯著降低，使其更加接近實際骨的彈性模量。此外，具有接近骨的分形維度的仿生組比表面改性組顯示出更優(yōu)越的修復效果，其粗糙度類似于骨?？磥?，分形維度可能比表面粗糙度對骨修復有更大的影響。體內(nèi)和體外研究結果明確表明，該支架具有卓越的生物相容性、加速骨整合的能力以及促進骨修復和血管生成的能力。此外，本文還探討了利用光聲技術動態(tài)和原位監(jiān)測關鍵骨缺損修復，為促進血管化和加速骨整合的仿生支架提供了有力的證據(jù)。此外，本研究還為體內(nèi)觀察和評估生物材料提供了有價值的見解。這種治療方法還證明在減少多孔支架表面上未熔化顆粒方面有效，為3D打印多孔支架提供了強大的后處理技術。就實用性而言，提出的分形促骨仿生設計過程可以應用于各種金屬材料，為表面改性提供通用解決方案。該方法的可靠性和成本效益使其特別適用于大規(guī)模工業(yè)化。    

參考資料：https://doi.org/10.1002/adfm.202415880