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近日，收到某項(xiàng)目的FDA DMF文件缺陷信，要求補(bǔ)充研究的內(nèi)容大部分都是涉及致突變雜質(zhì)的鑒別、分類、定性和控制。部分內(nèi)容如“We acknowledge that you discuss control strategy for the impurities which could be present in the drug substance in sections 3.2.S.2.3, 2.4, and 3.2. We also acknowledged that you have provided risk assessment of potential genotoxicity for the PMIs listed in the  section 3.2.S.3.2 . However, we were unable to locate a hazard assessment for most of the actual as well as potential impurities in your submission. A complete hazard assessment for actual and potential impurities is recommended in Section 6 of the ICH M7 Guidance: Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk. Section 6 of the guidance describes the elements required for impurity hazard assessment and requires classification of each impurity according to Table 1. Classification of all impurities (Classes 1-5) should be justified by either predictive or empirical data and not by visual inspection or statements alone. In addition, please provide (Q)SAR data for the impurities such as Impurity SM2-1, Impurity SM2-2, Impurity SM2-5, ImpurityZJT1-1, Impurity ZJT1-3,  Impurity ZJT1-5, Impurity ZJT2-B, and Impurity C to support your proposed classification/justification. Supporting data, as applicable, should accompany the control strategy based on the outcome of the (Q)SAR prediction”。因此，結(jié)合前期項(xiàng)目的致突變雜質(zhì)的研究經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合現(xiàn)申報(bào)案例，和大家一起探討致突變雜質(zhì)的鑒別與分類。

ICH M7早期采用遺傳毒性雜質(zhì)（Genotoxic impurities）這個(gè)詞語進(jìn)行描述，后來修訂為致突變雜質(zhì)（mutagenic impurities），可見致突變物質(zhì)、遺傳毒性物質(zhì)是有區(qū)別的，它們和致癌物的區(qū)別和聯(lián)系可以用圖1進(jìn)行描述。致癌物是指導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，產(chǎn)生癌癥的物質(zhì)；遺傳毒性是指通過直接或者間接的作用對(duì)細(xì)胞遺傳物質(zhì)產(chǎn)生損害的物質(zhì)；而致突變物質(zhì)是指在較低水平時(shí)也有可能直接引起DNA 損傷，導(dǎo)致DNA 突變，可能引發(fā)癌癥的DNA 反應(yīng)性物質(zhì)，它可以通過標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）結(jié)果判定。所有的物質(zhì)分為致癌物和非致癌物；致突變物質(zhì)一定是遺傳毒性物質(zhì)，但是如果該致突變物質(zhì)在“嚙齒動(dòng)物生物測(cè)定（2年）中顯示為非致癌物”，那么該物質(zhì)就不是致癌物，同樣，某些遺傳毒性物質(zhì)在“嚙齒動(dòng)物生物測(cè)定（2年）中顯示為非致癌物”，那么該物質(zhì)也不是致癌物。

圖1 致癌物、遺傳毒性物質(zhì)、致突變物質(zhì)的關(guān)系

致突變物質(zhì)在較低水平就會(huì)引起DNA反應(yīng)性，理論上致突變物質(zhì)是沒有閾值機(jī)制的，也就是說只要是攝入0以上的該物質(zhì)就會(huì)有患癌的風(fēng)險(xiǎn)。而其他無致突變性的遺傳毒性或致癌物是有閾值機(jī)制的，基于Haber法則：濃度（C）×時(shí)長(zhǎng)（T）=常數(shù)（k），只有攝入量達(dá)到常數(shù)（k）以上，才會(huì)有患癌的風(fēng)險(xiǎn)。下面我們通過一些物質(zhì)案例來分析致癌物、遺傳毒性物質(zhì)、致突變物質(zhì)與癌癥之間的關(guān)系。

致突變致癌性物質(zhì)：以甲醛（CAS：50-00-0）為例，甲醛存在于紡織品、化妝品、水發(fā)食品或豆制品、室內(nèi)裝飾的膠合板、細(xì)木工板、中密度纖維板和刨花板等人造板材中。甲醛的細(xì)菌回復(fù)突變（Ames）試驗(yàn)呈陽(yáng)性，可引起骨髓細(xì)胞DNA斷裂或交聯(lián)，為致突變雜質(zhì)[2]。但是由于甲醛為內(nèi)源性代謝物，并且廣泛存在于自然環(huán)境中，其引入一個(gè)較高的可接受攝入量可能是合理的，其推薦的AI（可接受攝入量）為8000μg/天或215 ppb（取較低值）[1]。

致突變非致癌性物質(zhì)：以甲基溴（CAS：74-83-9）為例，甲基溴Ames試驗(yàn)呈陽(yáng)性，為致突變物質(zhì)[3]，但是其僅被證明具有毒性，而無法判斷其致癌性，因此世衛(wèi)組織將其歸為3類致癌物（不能確定能不能致癌，但是具有致癌的可能性），對(duì)于該化合物的控制，按照一般雜質(zhì)控制即可。查詢其毒理數(shù)據(jù)，大鼠口服LD50數(shù)據(jù)為104 mg/kg，狗口服12個(gè)月甲基溴的的NOEL(未觀察到作用水平)為0.27 mg/kg bw，可根據(jù)上述數(shù)據(jù)計(jì)算其限度[4]。

非致突變的遺傳毒性致癌物：遺傳毒性物質(zhì)按機(jī)理可以分為致突變物質(zhì)和染色體畸變物質(zhì)，非致突變的遺傳毒性致癌物也就是染色體畸變致癌物。以苯（CAS：71-43-2）為例，其以Ames試驗(yàn)呈陰性，為非致突變物質(zhì)，但是其可引起染色體畸變或產(chǎn)生畸形胚胎，因此屬于致染色體畸變物質(zhì)[5]。該物質(zhì)不按照致突變雜質(zhì)進(jìn)行控制，但是需要按照致癌物研究，根據(jù)其毒理閾值進(jìn)行控制，其限度不得過2ppm[6]。

非致突變的遺傳毒性非致癌物：也是致染色體畸變的非致癌物。以香芹酮（CAS：2244-16-8）為例，該物質(zhì)含有警示結(jié)構(gòu)，該種物質(zhì)致突變性測(cè)試是陰性，致染色體畸變性測(cè)試是陽(yáng)性，無致癌活性[7]。按照ICH M7的分類應(yīng)該屬于Class 5分類，按照一般雜質(zhì)進(jìn)行控制[1]。

非遺傳毒性的致癌性雜質(zhì)：以羥胺（CAS：7803-49-8）為例，其在細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中呈陰性，不通過DNA反應(yīng)性機(jī)制致癌，通過其他方式致癌[8]。查詢其毒理數(shù)據(jù)，女性24個(gè)月毒理試驗(yàn)，攝入量0.4 mg/kg bw/day，未發(fā)現(xiàn)與該物質(zhì)相關(guān)的影響[9]。

ICH M7關(guān)注的是致突變雜質(zhì)，首先根據(jù)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索雜質(zhì)的相關(guān)致癌性和Ames數(shù)據(jù)，然后根據(jù)結(jié)果分類為1,2,5類；如果無法找到相關(guān)數(shù)據(jù)，應(yīng)進(jìn)行SAR評(píng)估，根據(jù)評(píng)估結(jié)果分類為3類，4類和5類。但是，正如上述缺陷信中描述“Classification of all impurities (Classes 1-5) should be justified by either predictive or empirical data and not by visual inspection or statements alone”，1-5類雜質(zhì)的分類應(yīng)該通過預(yù)測(cè)或者經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)來證明，而不是僅僅通過目視檢查或陳述。在FDA2021年3月進(jìn)行了DMF培訓(xùn)中，Drug Master File and Drug Substance Workshop – FDA CDER SBIA Events在day2: ICH M7(R1) – Chemistry and Manufacturing Control (CMC) Perspective on Hazard Assessment – Barbara O. Scott 中明確指出了相同的描述：“NOTE: Visual inspection of a compound for structural alerts for classification purposes is not M7 compliance”。

現(xiàn)在市面上的SAR評(píng)估軟件較多，這些軟件或方法都是基于專家規(guī)則或統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)則。我最常用的軟件是基于專家規(guī)則的Toxtree以及基于統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)則的VEGA，如果這兩個(gè)軟件得出一致的結(jié)論，則一般不再繼續(xù)討論，如果得出的結(jié)果不相同或者出現(xiàn)如其中一個(gè)為陽(yáng)性，則會(huì)對(duì)該雜質(zhì)采用商業(yè)化評(píng)估軟件如Derek/Sarah Nexus等軟件進(jìn)行評(píng)估，以商業(yè)化評(píng)估軟件出具的結(jié)果為準(zhǔn)。

我們以本次補(bǔ)充研究的雜質(zhì)SM2-1為例介紹各軟件的結(jié)果。首先對(duì)我們用Toxtree軟件得出高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果，結(jié)果見圖2。我們使用VEGA軟件預(yù)測(cè)得出陰性數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖3。由于兩個(gè)軟件得出了相反結(jié)論，我們又使用商業(yè)化軟件Derek/Sarah Nexus進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果為陰性，其結(jié)果見圖4。綜合上述預(yù)測(cè)結(jié)果，我們判定該雜質(zhì)為致突變陰性，歸為5類雜質(zhì)，按照一般雜質(zhì)進(jìn)行控制。

圖2  SM2-1致突變性預(yù)測(cè)結(jié)果（Toxtree軟件）

圖3  SM2-1致突變性預(yù)測(cè)結(jié)果（VEGA軟件）

圖4  SM2-1致突變性預(yù)測(cè)結(jié)果（Derek/Sarah Nexus軟件）

致突變雜質(zhì)的研究是藥品CMC研究中的關(guān)鍵部分，現(xiàn)在不論是CDE，還是FDA、EDQM，都對(duì)致突變雜質(zhì)的要求越來越嚴(yán)格，F(xiàn)DA甚至要求將所有的雜質(zhì)都進(jìn)行QSAR評(píng)估，以判斷雜質(zhì)的致突變性，因此論證雜質(zhì)的致突變性、遺傳毒性、致癌性越來越重要，并且需要在申報(bào)資料中詳細(xì)闡述論證的過程和證據(jù)。因此我們首先需要明確各類雜質(zhì)的定義和分類，然后提前評(píng)估警示結(jié)構(gòu)、查詢文獻(xiàn)、進(jìn)行QSAR評(píng)估，如有必要，進(jìn)行Ames試驗(yàn)，防止因?yàn)檠a(bǔ)充研究影響審評(píng)進(jìn)度，更防止因?yàn)閷⒅峦蛔冸s質(zhì)按一般雜質(zhì)控制，導(dǎo)致產(chǎn)品不合格，影響項(xiàng)目審評(píng)。

參考文獻(xiàn)

[1] Assessment and control of DNA reactive(mutagenic) impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risk. ICH

[2] https://cebs.niehs.nih.gov/cebs/study/002-02185-0005-0000-3. NTP

[3] https://cebs.niehs.nih.gov/datasets/search/ames?casrn=74-83-9. NTP

[4] https://echa.europa.eu/registration-dossier/-/registered-dossier/5298/7/6/1. ECHA

[5] https://echa.europa.eu/registration-dossier/-/registered-dossier/16102/7/7/1. ECHA

[6] Q3C(R9)：Impurities: Guideline for Residual Solvents. ICH

[7] https://cebs.niehs.nih.gov/datasets/search/ames?casrn=2244- 16-8. NTP

[8] https://echa.europa.eu/registration-dossier/-/registered-dossier/17464/7/7/1.ECHA

[9] https://echa.europa.eu/registration-dossier/-/registered-dossier/16246/7/6/1.ECHA