中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

對于細(xì)胞治療產(chǎn)品來講，成瘤性（tumorigenicity）評估是非臨床研究中的重要一環(huán)。成瘤性指細(xì)胞接種動物后在注射部位和（或）轉(zhuǎn)移部位由接種細(xì)胞本身形成腫瘤的可能性，即接種的細(xì)胞自身形成腫瘤的可能性。

干細(xì)胞因其潛在的增殖和分化能力，是成瘤性關(guān)注的重點藥物類型。干細(xì)胞主要分為兩類：多能干細(xì)胞（pluripotent stem cells, PSCs）和成體干細(xì)胞（somatic stem cells）。PSCs是在胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生的，可以分化為胚胎的內(nèi)胚層、中胚層或外胚層，也就意味著能發(fā)育成機(jī)體的各種器官或組織。但PSCs僅在胚胎中存在，倫理方面的考量限制了這類干細(xì)胞的使用。2006年，Shinya Yamanaka團(tuán)隊對成纖維細(xì)胞進(jìn)行基因改造，使其具備了分化能力，繼而出現(xiàn)了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）。iPSCs目前已經(jīng)能分化出100多種不同細(xì)胞。除了多能干細(xì)胞，還有一類稱之為成體干細(xì)胞的存在，包括間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）、造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells, HSCs）、神經(jīng)干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞等。不過，成體干細(xì)胞的分化能力比較弱，只能分化為特定的幾種細(xì)胞，相應(yīng)的成瘤性風(fēng)險也較多能干細(xì)胞低。

2010年，首個人胚胎干細(xì)胞產(chǎn)品在美國進(jìn)入臨床。首個自體移植、異體移植來源于誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分別于2014年和2017年在日本開展臨床研究，用于年齡相關(guān)黃斑變性治療。當(dāng)然，現(xiàn)在處于臨床階段的干細(xì)胞產(chǎn)品就更多了，評估這些產(chǎn)品形成腫瘤的風(fēng)險對人體來講非常重要。

成瘤性試驗傳統(tǒng)方法是將細(xì)胞移植在免疫缺陷鼠體內(nèi)，比如移植到皮下、腎包膜或睪丸包膜部位，之后監(jiān)測瘤塊的形成。但動物試驗的靈敏度受種屬、免疫缺陷程度等影響，會出現(xiàn)一定變異。而且，動物試驗與人體的相關(guān)性也存在擔(dān)憂。此外，還要考慮動物試驗“3R”原則。鑒于此，體外試驗的優(yōu)先級逐漸提高。

考慮到成瘤性試驗在細(xì)胞治療產(chǎn)品開發(fā)中的重要性，多國監(jiān)管機(jī)構(gòu)均出臺了相應(yīng)指導(dǎo)原則對其進(jìn)行約定。

EMA在“Guideline on human cell-based medicinal products (EMEA/CHMP/410869/2006)”提到，如果產(chǎn)品有細(xì)胞轉(zhuǎn)化風(fēng)險，就應(yīng)開展成瘤性研究，包括增殖潛力、整合進(jìn)染色體能力。在“Reflection paper on stem cell-based medicinal products (EMA/CAT/571134/2009)”中對干細(xì)胞進(jìn)行了特別說明，對于多能干細(xì)胞（PSC）和成體干細(xì)胞，成瘤是其固有風(fēng)險，由其內(nèi)在屬性決定。這類產(chǎn)品在培養(yǎng)過程中也會存在基因不穩(wěn)定風(fēng)險。未分化、具備增殖能力的干細(xì)胞（如誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）和胚胎干細(xì)胞（ESC）具備高成瘤風(fēng)險。EMA認(rèn)為iPSC和ESC的致畸胎瘤風(fēng)險明顯高于成體干細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞等。

早在2008年，F(xiàn)DA針對ESC就出臺過文件，對于ESC細(xì)胞治療產(chǎn)品中殘留的未分化ESC因其成瘤風(fēng)險，應(yīng)該在生產(chǎn)過程及批放行中進(jìn)行檢測。檢測方法可以是流式細(xì)胞術(shù)，也可以是RT-PCR。2013年，F(xiàn)DA出臺了“Guidance for industry: Preclinical assessment of investigational cellular and gene therapy products”，要求對細(xì)胞治療產(chǎn)品的成瘤性給予特別關(guān)注。FDA承認(rèn)在成瘤性方面，關(guān)于最相關(guān)動物種屬或動物模型的臨床預(yù)測性，在科學(xué)上尚未形成統(tǒng)一共識。盡管如此，動物研究是現(xiàn)階段相對接近的路徑，可以通過設(shè)計足夠長觀察周期，將細(xì)胞產(chǎn)品移植入臨床擬用解剖部位等方式增加可預(yù)測性。

2012年，日本MHLW出臺了一系列針對自體、異體的成體干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞的臨床前研究指南，如下圖所示。MHLW各指南中，對成瘤性研究也進(jìn)行了討論。建議申請人對干細(xì)胞的成瘤可能進(jìn)行評估，如有必要，應(yīng)開展合適的動物研究。

2017年，中國CDE在“細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）”提到，安全性研究根據(jù)細(xì)胞來源和制備工藝過程的特點，針對成瘤性開展相關(guān)研究。2024年1月，CDE頒布的“人源干細(xì)胞產(chǎn)品非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則”指出，干細(xì)胞產(chǎn)品、干細(xì)胞產(chǎn)品中殘留的未分化細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能存在致癌性風(fēng)險，致癌性是干細(xì)胞產(chǎn)品安全性評價的重點關(guān)注內(nèi)容，需開展成瘤性和致瘤性試驗。

各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)雖然對細(xì)胞治療產(chǎn)品的成瘤性風(fēng)險都給予了關(guān)注，但都是籠統(tǒng)描述，不涉及具體的評價策略和試驗內(nèi)容建議。

成瘤性風(fēng)險主要來源于3點，細(xì)胞治療產(chǎn)品中殘留的多能干細(xì)胞、細(xì)胞治療產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化潛能、基因不穩(wěn)定。以殘留的多能干細(xì)胞為例，如果誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞終產(chǎn)品中，依然殘留有具有增殖能力的多能干細(xì)胞，即使殘留量很少，也有極大風(fēng)險在注射部位形成畸胎瘤或囊腫，如下圖所示，需要引起充分重視。

那么干細(xì)胞產(chǎn)品中究竟含有多少成瘤細(xì)胞才會真正成瘤呢？換言之，成瘤細(xì)胞含量的閾值是多少呢？理論上，單個的腫瘤干細(xì)胞就可以成瘤，那非腫瘤類干細(xì)胞的檢測靈敏度需要達(dá)到能分辨出單一細(xì)胞嗎？從現(xiàn)有研究報道看，目前尚未見單一干細(xì)胞，無論是處于未分化還是分化階段，在體內(nèi)成瘤的案例。通常，胚胎干細(xì)胞形成畸胎瘤的閾值細(xì)胞數(shù)量是100-10000/百萬個細(xì)胞，單個胚胎干細(xì)胞或者iPSC很難存活或擴(kuò)增。有人將10個胚胎干細(xì)胞接種到免疫缺陷鼠，30只動物均未見出現(xiàn)畸胎瘤。因此，干細(xì)胞成瘤試驗的靈敏度不需要達(dá)到區(qū)分單一細(xì)胞的程度，但也要足夠靈敏，比如0.001%，即100細(xì)胞/百萬。

成瘤試驗方法

體內(nèi)方法

雖然對動物試驗的轉(zhuǎn)化結(jié)果存在一定爭議，但目前尚無其它更有效試驗方法可以替代動物。動物依然是細(xì)胞治療產(chǎn)品成瘤性研究的金標(biāo)準(zhǔn)。常用于成瘤性評估的是嚴(yán)重免疫缺陷的動物，如T、B和NK功能缺陷的NOG、NSG小鼠。也有用免疫缺陷大鼠，大鼠的優(yōu)勢是可以承載更多劑量，也更容易進(jìn)行復(fù)雜手術(shù)，如椎管內(nèi)、心肌內(nèi)給藥。無論采用哪種動物模型，均需要證明細(xì)胞移植成功，并能在動物體內(nèi)長期存活。大部分研究者將動物成瘤觀察周期定為10-36周。FDA建議4-7個月。FDA對腫瘤生長的微環(huán)境比較關(guān)心，可能會影響細(xì)胞治療產(chǎn)品的成瘤性。因此，建議動物接種細(xì)胞的位點最好與人體一致。不過，F(xiàn)DA未對其合理性進(jìn)行詳細(xì)說明。動物中的給藥劑量優(yōu)選人體實際用藥劑量或最大可行劑量。如果藥物給予特定區(qū)域如腦、脊髓、心臟或眼睛，也可以考慮根據(jù)器官重量或者靶部位體積對給藥劑量進(jìn)行種屬間折算。動物研究流程如下圖所示。

體外方法

目前已經(jīng)開發(fā)出大量體外方法用于成瘤性評價，這些方法高度靈敏且特異性強(qiáng)，可準(zhǔn)確估計細(xì)胞治療終產(chǎn)品、中間體的成瘤情況。相關(guān)方法及優(yōu)缺點如下表所示。

細(xì)胞治療產(chǎn)品成瘤的兩大風(fēng)險分別是殘留的未分化細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。可以基于RT-PCR、highly efficient culture方法檢測殘留PSCs，或者采用digital soft agar colony formation方法檢測轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。PCR（RT-PCR、ddPCR）是在基因?qū)用孢M(jìn)行分析，比如LIN28基因作為未分化胚胎干細(xì)胞的marker之一，通過檢測該基因確定殘留未分化干細(xì)胞含量。但對于表達(dá)該基因的細(xì)胞如人腦細(xì)胞，就需要更換其它基因標(biāo)記物，如ESRG、CAMKV、IDO1、CNMD、LIDT1、LCK等。PCR從提取RNA到出結(jié)果大概需要2-3h，比動物試驗的周期短很多。下表總結(jié)了用于未分化胚胎干細(xì)胞或iPSCs檢測的候選基因及可達(dá)到的檢測靈敏度。

細(xì)胞法更多是在蛋白水平進(jìn)行確認(rèn)。通過包含不同熒光的抗體雞尾酒，可以對多種蛋白進(jìn)行標(biāo)記和檢測。不過，流式細(xì)胞術(shù)如果要達(dá)到0.01%靈敏度，1%變異，需要至少收集1*108個細(xì)胞，對產(chǎn)品和試劑的需求量很大，檢測耗費(fèi)時間也久。當(dāng)然，目前也有些新的細(xì)胞檢測技術(shù)出來，比如Stem Cell Quantitative Cytometry (SCQC)system，不再展開。

PCR也好、細(xì)胞法也罷，我們會發(fā)現(xiàn)都需要依賴特定基因或蛋白。通過標(biāo)定潛在成瘤細(xì)胞特異性表達(dá)的基因或蛋白實現(xiàn)定量。不同干細(xì)胞的標(biāo)記物可能不同。另外，終產(chǎn)物中含有該基因也不見得一定成瘤。那有沒有一種更為普適的方法？

軟瓊脂集落形成實驗（soft agar colony formation assay）可以不依賴任何標(biāo)記體外檢測細(xì)胞產(chǎn)品的成瘤性。如下圖所示，將產(chǎn)品制備成單細(xì)胞懸液，與瓊脂糖凝膠混合后接種至培養(yǎng)皿。成瘤細(xì)胞形成的集落更大，侵襲性更強(qiáng)。有團(tuán)隊將0.0001%的HeLa腫瘤細(xì)胞/間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行軟瓊脂實驗，可以明顯觀察到大的集落的形成，靈敏度非常高。軟瓊脂實驗不僅可以用于干細(xì)胞成瘤性評估，也適用于其他基因編輯細(xì)胞。當(dāng)然，軟瓊脂實驗在檢測周期這塊，與PCR或細(xì)胞法相比，并不討好。以HeLa細(xì)胞為例，傳統(tǒng)培養(yǎng)條件下的軟瓊脂實驗需要30天左右，即使改進(jìn)培養(yǎng)條件，也需要至少2周左右。因此，可先用短、平、快的PCR或細(xì)胞法進(jìn)行初驗證。

遺傳的不穩(wěn)定性是細(xì)胞治療產(chǎn)品成瘤的一大風(fēng)險，比如可能的基因突變、基因擴(kuò)增、核型異?；蛉旧w重排。雖然遺傳不穩(wěn)定與細(xì)胞類型、培養(yǎng)方法等因素相關(guān)，但比較建議的方案是減少培養(yǎng)時間、減少細(xì)胞傳代，并盡可能獲得遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞產(chǎn)品。用于檢測遺傳穩(wěn)定性的方法包括G-banded karyotyping, fluorescence、in situ hybridization (FISH)、array comparative genomic hybridization (aCGH)、single nucleotide polymorphism (SNP) array、next-generation sequencing (NGS)。但是，目前的難點是如何對這些體外試驗的結(jié)果進(jìn)行解釋，比如出現(xiàn)遺傳修飾的數(shù)量與實際成瘤風(fēng)險相關(guān)性的建立。畢竟不是有1個突變就會導(dǎo)致產(chǎn)品成瘤。

除了以上體內(nèi)和體外手段外，隨著器官芯片技術(shù)的發(fā)展，將人體細(xì)胞或組織與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)，建立人體模擬度更高的微環(huán)境也是一個方向，并已經(jīng)取得一些進(jìn)展，可以潛在更客觀、真實的評價細(xì)胞治療產(chǎn)品的成瘤性。