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一、實驗原理

PCR擴增產物經過瓊脂糖凝膠電泳后，按分子量大小被分開，排列在凝膠中，跟DNAMarker分子量的對比下，找到目的DNA帶所在的凝膠，并把它切下來，加熱或用特殊的試劑熔解凝膠，使DNA溶回到溶液中，再經過乙醇沉淀或過柱即可獲得目的DNA片段。

二、實驗器材與試劑

器材：

紫外檢測儀、電子天平，恒溫水浴鍋，臺式離心機，快速混勻器，冰箱，滅菌鍋、微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5mL微量離心管，雙面微量離心管架，水漂，刀片，一次性手套等。實驗前把1.5mL微量離心管裝入鋁制飯盒高溫滅菌、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒高溫滅菌。

試劑：

DNA分子量標準（DNA Marker-D：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）。DNA快速純化/回收試劑盒（BS363 EZ Spin Column PCR Product Purification ，100次）（500bp以上片段，回收率90%以上），無水乙醇。

三、實驗操作步驟

1.將PCR反應的混合物轉移到一個1.5mL的微量離心管中，加入3倍體積的Binding Buffer Ⅰ。

2.將column放入一個2mL的收集管中，轉移上一步的混合液到column中，在室溫下豎直放置2min，8000rpm離心1min。

3.棄去流入收集管中的液體，加500μL Wash Solution到column中，12000rpm離心1min。棄去收集管中的液體，將column放回原來的收集管中。

4.再加500μL Wash Solution到column中，12000rpm離心1min。棄去收集管中的液體，再次離心去除殘留的Wash Solution。

5.將column轉移到一個干凈的1.5mL微量離心管中。在column中的膜的中央部分加30~50μL Elution Buffer，50℃溫浴2min。12000rpm離心1分鐘。將PCR產物置于-20℃冷凍保存或即刻使用。

（其中，實驗操作步驟中所使用的為生工公司的SanPrep 柱式 DNA 膠回收試劑盒Order NO. B518131）

四、常見問題

1、目的產物回收率低：

紫外下切膠過慢，核酸長時間暴露在紫外線下，結構等可能發(fā)生變化，從而失去功能，電泳使所用的電泳緩沖液長時間未更換，pH發(fā)生變化，影響DNA吸附。

2、洗脫效率低：

溶液轉移至吸附柱加入洗滌緩沖液離心兩次后，需要將裝有純化柱的管蓋打開，使殘留的乙醇揮發(fā)以提高得率，最后向純化柱加入洗脫緩沖液，必須確保緩沖液直接滴在膜上。

3、瓊脂糖凝膠未完全融化：

55℃水浴溶膠時，多次上下顛倒使凝膠充分熔化混勻，確保無固體瓊脂糖殘留，膠融化后，一般情況下，將呈現下圖淡黃色或幾乎無色，而若存在部分影響因素會使得溶液pH發(fā)生變化，溶液顏色也可能發(fā)生改變，如膠塊過大使得pH偏高，那么就需要額外添加溶膠液至溶液顏色恢復正常。

4、凝膠切塊過大：

盡可能切除不含目的片段的瓊脂糖，得到的凝膠體積越小越好（圖示左側為合適大小的膠塊，右側為體積過大的膠塊）

5、外源DNA污染：

要盡可能確保清潔環(huán)境下進行操作以減少外源DNA的污染。

五、注意事項

1.使用試劑盒時，要細致觀察使用條件，例如漂洗液中是否加入一定體積的無水乙醇，體積數目根據試劑盒試劑要求而定等。

2.核酸染料的使用存在安全問題，要注意防護。