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色譜柱的關(guān)鍵內(nèi)容是制備出高效的填料，這些填料制成的色譜柱既要有好的選擇性，又要有高的柱效，要提高柱效是現(xiàn)代高效液相色譜的又一關(guān)鍵問題，所以填料和裝柱技術(shù)是關(guān)鍵問題。

 

高效液相色譜是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法，其分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬，分別為聚合物填料、硅膠基質(zhì)填料和其它無機(jī)填料。要選擇合適的色譜填料，必須對(duì)此有一定的認(rèn)識(shí)和了解。

 

色譜填料的選擇

 

1、硅膠基質(zhì)填料

 

硅膠是HPLC填料最普遍的基質(zhì)。除了具有無機(jī)物基質(zhì)共有的高強(qiáng)度，還提供了一個(gè)表面，可以通過成熟的硅烷化技術(shù)鍵合范圍很廣的配基，制成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜。硅膠基質(zhì)填料適用廣泛的溶劑，從極性到非極性。其缺點(diǎn)是在水溶性堿性流動(dòng)相中不穩(wěn)定。通常，硅膠基質(zhì)的填料推薦的常規(guī)分析pH范圍為2～8。

 

（1）正相色譜

正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica)以及其它具有極性官能團(tuán),如胺基團(tuán)(NH2,APS)和氰基團(tuán)(CN,CPS)的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基(SiOH)或其它極性基團(tuán)極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中各組份的極性大小，即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動(dòng)相極性相對(duì)比固定相低，如：正己烷(Hexane)、氯仿(Chloroform)、二氯甲烷(Methylene Chloride)等。

 

（2）反相色譜

反相色譜用的填料常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對(duì)較弱的官能團(tuán)的鍵合相。反相色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng)，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組份最先被沖洗出，而極性弱的組份會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。

常用的反相填料有：C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。

 

2、聚合物填料

聚合物填料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其優(yōu)點(diǎn)是在PH值為1～14均可使用。相對(duì)于硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有較強(qiáng)的疏水性，而且大孔的聚合物對(duì)蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效。其缺點(diǎn)是相對(duì)硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。

 

3、其它無機(jī)填料

其它HPLC的無機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化由于其特殊的性質(zhì)，一般僅限于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐漸成為反向色譜柱填料。這種填料的分離不同于硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合相硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng)。石墨化碳可用于分離某些幾何異構(gòu)體，由于在HPLC流動(dòng)相中不會(huì)被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可以用于HPLC。氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點(diǎn)是可以在pH高達(dá)12的流動(dòng)相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物的作用也很強(qiáng)，應(yīng)用范圍受到一定限制，所以未能廣泛應(yīng)用。新型色譜氧化鋯基質(zhì)填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)用pH1～14，溫度可達(dá)100℃。由于氧化鋯填料是最近幾年才開始研究，加之面臨的實(shí)驗(yàn)難度，其重要用途與優(yōu)勢(shì)尚在進(jìn)行之中。

 

填料粒度的選擇

 

目前，高效液相色譜柱廠家色譜填料粒度從1 um到超過30 um均有銷售，而目前分析分離主要用3 um和5 um填料進(jìn)行。填料的粒度主要影響 填充柱的兩個(gè)參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，柱壓越大，柱壓的增加限制了粒度小于3 um的填料應(yīng)用。在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯 一的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3 um填料填充柱的柱效比相同條件下的5 um填料的柱效提高近 30%；然而，3 um的色譜柱的背壓卻是5 um的2倍。與此同時(shí)，柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱，即相同的塔板數(shù)或分離能力，但是柱長 更短，以縮短分析時(shí)間。另外，可以采用低粘度的溶劑做流動(dòng)相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。

 

目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室是購買商品預(yù)填裝柱來滿足分離、分析之需。液相色譜柱、特別是高效液相色譜柱的填裝，需要有較高的技巧和熟練的技能。因此，有人甚至將“裝柱”看作是“藝術(shù)加技術(shù)”。

 

但是只要掌握了一些基本的規(guī)律和方法，任何實(shí)驗(yàn)室都可以填裝出具有較高柱性能的色譜柱。

 

色譜柱的填裝方法

 

在有關(guān)色譜基本理論的討論中可以得知，發(fā)生在色譜柱中總的譜帶展寬效應(yīng)與流動(dòng)相的線速度、粒徑以及溶質(zhì)在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)、溶質(zhì)在固定相中的擴(kuò)散系數(shù)等密切相關(guān)。對(duì)于給定粒徑的填料來說，能否填充成均勻而緊密的柱床，是得到高性能柱子的關(guān)鍵，而采用粒徑細(xì)且分布均勻的優(yōu)質(zhì)填料，則是得到高性能柱子的最基本保證。

 

1、高壓勻漿法裝填

將填料懸浮在適宜的勻漿液中制成勻漿，在其尚未沉降之前，很快以高壓泵將其以很高 的流速壓進(jìn)柱中，便可制備出填充均勻的柱子。這是常見的分析和制備色譜柱的裝填方法。

高壓勻漿法的設(shè)備，如圖所示。

 

裝柱機(jī)的核心是氣動(dòng)放大泵，通常多設(shè)計(jì)放大率為100，即低、高壓柱塞直徑比為10:1，面積比為100:1的氣動(dòng)放大系統(tǒng)。若低壓端輸入1MPa壓強(qiáng)的壓縮空氣（通?？捎脡嚎s空氣鋼瓶供給），則相同的壓力會(huì)傳遞至高壓端柱塞上，而高壓柱塞面積僅為低壓端的1/100，因而其輸出壓強(qiáng)亦提高至100MPa。由于氣動(dòng)放大泵很容易獲得高壓、高流速的輸液，故很適于柱子的填充之需。

在裝柱之前，先確定所用的柱型，以確定選用多大的勻漿罐體積。例如，常用的“標(biāo)準(zhǔn)”HPLC柱為φ4.6mm×250mm，其內(nèi)腔體積約為4.2mL，約需3.5g填料。一般情況下，為保證填充的成功，需適當(dāng)過量15%-20%為宜。如使用4g填料充填它，選擇固 - 液比約為1:10，則勻漿罐體積以4mL為宜。若罐過大，則可在勻漿罐內(nèi)裝入一個(gè)以惰性材料（如聚四氟乙烯或不銹鋼）制的襯套將其調(diào)整至所需體積。

將選用的柱子仔細(xì)以乙醇或丙酮清洗干凈，并以干凈的熱風(fēng)吹干。如柱管內(nèi)壁污染較重，也可以用表面活性劑及去離子水依次清洗，并以長竹簽或塑料棒扎上棉紗或紗布往復(fù)抽擦，以除去污垢。但應(yīng)注意不要傷及內(nèi)壁表面的光潔度，尤其不能造成軸向的劃痕。將清潔的柱管的一端裝配上帶濾板的柱頭，另一端則連接至勻漿罐上。

配制勾漿液是高壓勻漿法的重要一環(huán)，不同的填料應(yīng)采用不同的勻漿液。不同的文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室所報(bào)道的勾漿液的種類和比例有所不同。例如，填充硅膠正相柱，可以使用1:1 的氯仿/甲醇；對(duì)于C18反相填料，可以使用適宜比例的正己烷4氯仿混合溶劑。若有四溴乙烷等高密度溶劑，也可以以2:1的高密度溶劑與40%的二氧六環(huán)和40%的四氯化碳配成勻漿液。稱取所需重量的填料，將其置小燒杯中，按其重量的10 倍量（一般也可以按體積計(jì)，即10mL的勻漿液中加入1g 重的填料）加入勻漿液。搖動(dòng)或攪拌均勻后，將其移至超聲波浴中，以中強(qiáng)的超聲波令填料粒子均勻而穩(wěn)定地懸浮起來。最后，再以強(qiáng)超聲短時(shí)間強(qiáng)化一下。超聲處理的時(shí)間不宜過長，一般應(yīng)不超過2-3min，過長則可能造成顆粒的破碎。

將準(zhǔn)備好的勾漿液立即倒入勻漿罐中，裝滿后，將勻漿罐蓋好、旋緊，再以針筒抽取一定量的勻漿液，從蓋子上的連接孔中插入勻漿罐內(nèi)部并加注勻漿液至從連接孔中溢出為止。這一操作的目的是排除勻漿罐中的空氣泡，空氣泡的存在會(huì)妨礙向系統(tǒng)中迅速地施加壓力。抽出注射針并將罐與氣動(dòng)放大泵的出液管路相連。確認(rèn)連接正確且牢固后，即可開啟放大泵的截門，令貯存于氣動(dòng)放大泵內(nèi)的頂替液（正相時(shí)可以使用氯仿，反相時(shí)可使用甲醇）高速壓入罐內(nèi)。

以常見的5μm多孔硅膠填料為例，填裝壓力為50MPa左右（細(xì)孔硅膠可至70MPa）。這里使用的是瞬間升壓的方式，也有文獻(xiàn)報(bào)道使用程序加壓。加壓時(shí)，勻漿液中的填料滯留于柱尾的濾板上而勻漿液則被排除于柱外。開始時(shí)，排出的勻漿液因含部分氣體，釋壓后會(huì)逸出而使液體渾濁。待全部勻漿液被排出后，因頂替液黏度較少而流速亦稍加大，且排出液有明顯的外觀上的變化。

此時(shí)，可以稍稍降低填充壓力，例如，降至約35MPa，并維持30-40min，然后，在約30min, 內(nèi)逐步將壓力降至常壓。降至常壓后，宜靜置一段時(shí)間，例如30min,，以讓柱床內(nèi)的壓力平衡。否則，過早拆卸下已填充的柱子時(shí)，會(huì)因柱子內(nèi)部的殘余壓力而將柱頭上的填料擠出往外。拆下已填裝好的柱子并裝配上帶有篩板（濾網(wǎng)）的柱頭（注意：一定要將沾在柱頭錐套上的填料除凈，否則會(huì)影響到柱子的密封性），做好標(biāo)記，即已完成柱子的填裝。

在上述填裝程序中應(yīng)該注意的問題是：

①高壓操作的安全問題。常發(fā)生的問題是柱子與勻漿罐連接不牢，造成加壓時(shí)柱頭被高壓沖下或柱子從勻漿罐上滑脫。此時(shí)，輕則填裝失敗，材料損失，重則造成人身傷害事故，一定要加以防范。除每次填裝前均須仔細(xì)確認(rèn)是否連接正確且牢靠外，最好還可加上由法蘭盤和長螺桿組成的預(yù)防脫落裝置，以防萬一。

②通常，先填裝的柱床較后填裝的柱床緊密。因此，當(dāng)使用時(shí)宜以相反的方向?yàn)橐?，即讓近勻漿罐一端作為使用時(shí)流動(dòng)相的出口，而填裝時(shí)的出口端則作為流動(dòng)相的入口。

③新柱子使用前應(yīng)以甲醇沖洗20-30min, 后，再改用流動(dòng)相平衡。

④新柱子宜選適宜的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)并記錄，以備存查和比較。

實(shí)驗(yàn)和理論研究均指出，以上述下流式勻漿法難以填裝成長柱子，其原因是，隨著已填充柱床的增高，對(duì)流體的阻力亦逐漸增加，使在一定壓力下通過柱床的流速降低，亦即柱床的增長速度變慢，在這一過程中，填料顆粒的沉降亦在進(jìn)行，導(dǎo)致所填充柱床的緊密性和均勻性降低。為保證達(dá)到一定柱效，一次填充的單柱長度不宜過大。有文獻(xiàn)指出，使用6mm內(nèi)徑的柱子，5μm粒徑填料，適宜的單柱柱長為10-15cm。但是近年來，φ4.6×250mm的預(yù)裝柱已被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)柱型，在這樣的柱子上，多能獲得≥80000片/m理論塔板的柱效。

為制取更長的柱子，可以使用上行法（圖12-2-10）。曾有報(bào)道，使用3μm 填料，以上行法可以制備長達(dá)1m 的柱子，且其柱效與短柱子相類似。上行法中使用的勻漿液濃度比下行法要小一些，速度也慢一些，因此所填充的柱床相對(duì)較均勻。近年來，由于微柱色譜和毛細(xì)管電色譜的發(fā)展，需要填微色譜柱乃至毛細(xì)管色譜柱，而上行法則可以用作為微柱的填充方法之一。

 

2、濕法裝填

對(duì)于高效柱、特別是現(xiàn)在流行的以3-10μm細(xì)柱徑填料填裝的高效分析柱，則必須使用濕法，即勻漿法裝柱。因?yàn)?，隨著粒徑的縮小，因靜電作用和表面能的加大，粒子間傾向于聚集和“粘結(jié)”，若以干法填裝，它們會(huì)粘附在連接管及柱壁上，也會(huì)因強(qiáng)烈的靜電作用彼此排斥，因而難以填裝出均勻而緊密的柱床。這樣，必須改以濕法裝填，即將填料懸浮于適宜的液體中消除上述不良作用。但是，在固 - 液系統(tǒng)中仍然存在因重力而引起的沉降現(xiàn)象。粒子沉降的速度V為：

 

式中，g為重力加速度（cm/s2 ），d為粒子直徑（cm），ρ為粒子密度（g/cm3），ρo為液體密度（g/cm3），η為液體的黏度（mPa·s）。

從上述公式可知，粒子在液體中的沉降速度，與粒徑直徑的平方以及液 - 固密度之差成正比，而與液體黏度成反比。據(jù)此，濕法填裝可以依阻止沉降的思路分成三種：一條思路是設(shè)法尋找與硅膠密度相近的溶液，以使（ρ-ρ0）減小而降低沉降速度。第二種方法是增加液體的黏度以阻止粒子的下沉。第三種方法是綜合利用前兩種方法，盡力減小沉降并盡快地在發(fā)生較顯著的沉降之前完成裝柱操作。

 

3、干法裝填

對(duì)于粒徑較大的填料（多用于制備色譜），如粒徑≥20μm的填料，可以用干法裝填，其基本方法與填裝氣相色譜柱類似。但需注意的一點(diǎn)是，在干法填裝制備液相色譜柱時(shí)，不要過分劇烈地振動(dòng)和敲打。振動(dòng)和敲打會(huì)使填料因自身粒徑的不均勻性而產(chǎn)生柱子整體上的不均一性，即較大的填料粒子靠近柱壁，而較細(xì)粒徑者則傾向集中于柱中心。這種柱內(nèi)顆粒分布的不均勻性，會(huì)導(dǎo)致柱效的降低。比較好的方法是采用小量多次的方法向柱內(nèi)加入填料，例如每次加入相當(dāng)于3-5mm柱床的填料，裝一點(diǎn)即在實(shí)驗(yàn)臺(tái)或桌面上垂直地輕輕磕幾十下，續(xù)加一些填料后，重復(fù)上述操作，直至填裝完成。

 

4、等密度法裝填

在HPLC發(fā)展的早期，常采用“等密度法”來填裝高效柱。多孔硅膠的骨架密度較高。例如，LiChrospher 100的表觀密度約為2.3g/cm3，LiChrospher 500 為2.46g/cm3，LiChrospher 1000 為2.49g/cm3。不同牌號(hào)的硅膠因制法不同（例如，含有超細(xì)孔和封閉孔者表觀密度?。┒胁町悾嘣?.2g/cm3以上。因此，需以高密度溶劑配制密度與硅膠骨架密度相近的混合液。常使用的高密度溶劑為碘代和溴代烷類（表1），再與適當(dāng)比例的其他溶劑相配，配制出具有密度適宜的液體，使填料能呈“失重”狀態(tài)懸浮于勻漿液中，以從容地用高壓泵將其壓入空色譜柱中，制出填裝均勻的高效色譜柱。

在配制上述等密度懸浮液時(shí)，除密度外，還要考慮填料的表面狀況與化學(xué)性質(zhì)。如填裝反相柱，應(yīng)選用極性較弱的溶劑，而填充正相柱，如以硅膠為填料時(shí)，則應(yīng)選擇極性較強(qiáng)的溶劑，以防止顆粒板結(jié)并保證有良好的潤濕性，以使填料顆粒均勻地分散在勻漿液中。但是，碘代或溴代烷價(jià)格昂貴且多數(shù)有較大的毒性，因此，這種方法目前已經(jīng)很少使用。不過，當(dāng)填料粒徑較大，且又難以干法填裝時(shí)，等密度法將能發(fā)揮出特殊的作用。

表1 常用于濕法填充的溶劑

 

5、高粘度法裝填

高粘度法，即使用黏度較高的勻漿液體系以阻止顆粒的沉降?？梢圆捎靡叶肌⒕垡叶?、甘油以及石蠟油等高黏度液體調(diào)配勻漿液。但是，高黏度導(dǎo)致流體阻力加大，必將延長裝柱時(shí)間且需使用更高的裝柱壓力，在實(shí)用上很不方便。因此，高黏度法已很少被采用。