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ELISA 即酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme - Linked Immunosorbent Assay），是一種常用的免疫學檢測技術，主要基于抗原與抗體的特異性結合以及酶的高效催化作用。常常用于檢測炎癥細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6等）。接下來以常規(guī)試劑盒為例，從標準曲線繪制、樣本濃度計算、數(shù)據(jù)驗證、結果解釋等步驟展開闡述：

1、標準曲線繪制

（1）用PBS緩沖液或試劑盒配置的標準品稀釋液對標準品進行溶解濃度為1000pg/ml，然后根據(jù)實驗需求進行稀釋，通常會得到6~8個不同濃度（1000、500、250、125、62.5、31.25、 15.625、0 pg/ml）的標準品溶液。稀釋倍數(shù)一般根據(jù)標準品的初始濃度和實驗的檢測范圍來確定。通常地，稀釋的標準品不得重復使用，未用完的標準品應按照一次用量分裝后，將其放在-20~-70℃貯存，一次性使用，避免反復凍融。

（2）按照 ELISA 實驗流程，將不同濃度的標準品溶液分別加入到酶標板的不同孔中，每個濃度設置多個重復孔（一般2個），同時進行封閉、加一抗、洗滌、加二抗、洗滌、顯色、終止反應等步驟。在操作過程中，要確保每個步驟的條件（如孵育溫度、時間、試劑用量等）一致，以減少實驗誤差。

實驗操作流程圖：空白孔：標準品/樣本稀釋液

（3）讀取吸光度值（OD 值）：使用酶標儀在450nm波長下讀取每個標準品孔的 OD 值。

（4）繪制標準曲線：在 Excel 中，將濃度和 OD 值的數(shù)據(jù)分別輸入兩列，選中數(shù)據(jù)區(qū)域后，通過插入圖表功能選擇散點圖，然后添加趨勢線，在趨勢線選項中勾選 “顯示公式” 和 “顯示 R² 值”。R² 值越接近 1，說明曲線的擬合度越好。直線方程一般為（m 為斜率，b 為截距），通過這個方程可以根據(jù)樣品的 OD 值（y 值）計算出樣品的濃度（x 值）。

2、數(shù)據(jù)處理

（1）標準品OD450：

（2）樣品OD450：

（3）excel標準曲線繪制 ：公式：y=-3E-06x2+0.0067x+0.1843

3、結果分析

1. 每個標準品和標本的OD值應減去空白孔的OD值， 如果做復孔，求其平均值。

2. 使用計算機軟件以吸光度OD值為縱坐標(Y)，相應的IL-1β標準品濃度為橫坐標(X)，生成相應的標準曲線，樣品的細胞因子含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

3. 若標本 OD 值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)算標本含量。

4、注意事項

1、加樣操作：加樣時應垂直加入標本或試劑，避免刮擦包被板底部，加樣過程中避免液體外濺和血清殘留在反應孔壁上。

2、洗滌過程：手工洗板加洗液時沖擊力不要太大，洗滌次數(shù)不要超過說明書推薦的洗滌次數(shù)，洗液在反應孔內(nèi)滯留的時間不宜太長，30左右即可。

3、孵育條件：嚴格控制孵育的溫度和時間，使用前需查看孵育箱溫度是否符合要求，盡量保證各孔之間的孵育條件一致。

4、顯色與終止反應：顯色液量不可過多，注意避光。終止反應要及時、準確，避免反應過度影響結果的準確性。