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一、實(shí)驗(yàn)原理

 

通常地，在未受到刺激的細(xì)胞中，NF-κB通常與抑制蛋白IκB結(jié)合形成復(fù)合物，存在于細(xì)胞質(zhì)中。然而，當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子（如IL-1β、TNF等）、脂多糖（LPS）等外界刺激時(shí)，在經(jīng)典的NF-κB信號通路中這些刺激信號首先與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合最后導(dǎo)致IκB被降解，進(jìn)而釋放出NF-κB二聚體，自由的NF-κB二聚體由于其C端結(jié)構(gòu)域上的核定位區(qū)域暴露，能夠通過核孔復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，NF-κB二聚體與有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)的基因啟動子區(qū)域或增強(qiáng)子區(qū)域特異性結(jié)合，啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。

 

 

NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，其活性受到嚴(yán)格調(diào)控。通過檢測NF-κB移位入核情況，可深入了解細(xì)胞在受到各種刺激（如細(xì)胞因子、病原體感染、物理化學(xué)因素等）后，NF-κB信號通路的激活機(jī)制，包括信號的起始、傳導(dǎo)、放大以及與其他信號通路之間的交互作用。另外，檢測其移位入核有助于確定在不同生理或病理?xiàng)l件下，NF-κB所調(diào)控的具體基因靶點(diǎn)，以及這些基因在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫反應(yīng)等過程中的作用。 

 

二、實(shí)驗(yàn)步驟

 

（1）細(xì)胞培養(yǎng)與刺激

 

準(zhǔn)備適合大小的無菌爬片放在12孔板中，可用PBS潤洗孔板使得玻璃爬片更加貼合孔板底部；狀態(tài)良好的細(xì)胞鋪于12孔板中，37°C、5%CO?培養(yǎng)48h。將細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右的濃度后，加入適當(dāng)?shù)拇碳?，如TNF-α或IL-1β，在特定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行刺激，同時(shí)設(shè)置未刺激的陰性對照組。

 

（2）處理孔板與固定細(xì)胞

 

處理好的孔板，PBS輕輕潤洗細(xì)胞2-3次，使用4%多聚甲醛在室溫下固定30min；固定完成后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次約5min，去除固定劑。

 

（3）細(xì)胞通透處理

 

PBS稀釋10% TritonX-100至0.2%加入固定的細(xì)胞中，室溫下通透孵育15min，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與抗原結(jié)合。隨后，用PBS潤洗3次，每次5min。

 

（4）封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)

 

使用5%牛血清白蛋白（BSA）室溫下孵育1h。孵育完成后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次10min。

 

（5）細(xì)胞免疫染色

 

用PBS配置5%牛血清白蛋白的稀釋液，稀釋抗-NF-κB抗體并孵育細(xì)胞， 4°C下孵育過夜。一抗孵育完成后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次10min。

 

（6）二抗染色

 

用PBS配置5%BSA的稀釋液，按照相應(yīng)比例稀釋熒光標(biāo)記的二級抗體孵育細(xì)胞，室溫下孵育1h。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次10min。

 

（7）細(xì)胞核染色

 

使用熒光染料，如DAPI或Hochecst，將細(xì)胞核染色，通常在室溫下孵育15min。然后用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次約10min。

 

（8）封片與觀察

 

準(zhǔn)備好鑷子并配置90%的甘油（丙三醇）進(jìn)行封片。通常地，一塊載玻片放置2塊爬片，首先在載玻片上滴加20ul90%甘油，用吸水紙吸干爬片上的液體，將細(xì)胞爬片倒扣在甘油滴或更換適量的抗熒光淬滅封片液進(jìn)行封片，并用高亮透明的指甲油在爬片周圍固定爬片。最后用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞免疫熒光。

 

（9）蔡司激光共聚焦顯微鏡（LSM900）的簡單操作步驟

 

1、開機(jī)流程：根據(jù)標(biāo)簽1-8的順序開機(jī)包括激光、顯微鏡、主機(jī)等。雙擊打開藍(lán)色ZEN System，等待系統(tǒng)自檢和初始化。

 

標(biāo)簽[1]：激光器，控制激光；鑰匙控制開啟時(shí)由【0】擰到【1】，例如圖1

 

標(biāo)簽[2、3]：總控制器

 

標(biāo)簽[4]：載物臺控制器

 

標(biāo)簽[5、6]:顯微鏡控制器

 

標(biāo)簽[7]:熒光光源開關(guān)

 

標(biāo)簽[8]：電腦主機(jī)

圖1 標(biāo)簽【1、2、3】

 

圖2 顯微鏡的大致組成（激光、顯微鏡、主機(jī)）

 

2、拍攝2D圖像

 

1）在軟件界面中找到Locate按鈕，點(diǎn)擊其中的BF，GFP等快捷鍵(快捷按鈕選擇樣品染料顏色)，切換至人眼觀察模式。在TFT觸摸屏上，找到所選用物鏡，調(diào)好焦距。找到焦平面。

 

2）切換至Acquisition，點(diǎn)擊Smart Setup，選擇所用熒光染料。選擇模式，自動匹配光路設(shè)置。

 

3）在Channels菜單欄中調(diào)節(jié)激光強(qiáng)度與Master Gain值。在live預(yù)覽模式下使用Range Indicator判定圖像質(zhì)量。

 

4）當(dāng)圖像出現(xiàn)藍(lán)色背景與即將出現(xiàn)紅色過曝光點(diǎn)時(shí)stop并設(shè)置Acquisition Mode.選擇合適的像素分辨率掃描速度等。

 

5）點(diǎn)擊Snap按鈕，拍攝并注意保存。

 

3、拍攝Airyscan 超高分辨率圖像

 

1）點(diǎn)擊Smart Setup，選擇需要的染料；點(diǎn)擊Airyscan。

 

2）在Channels菜單欄中調(diào)節(jié)激光強(qiáng)度與MasterGain值，注意不要過曝:

 

3）在Acquisition Mode選擇最快的掃描速度，不做平均，Zoom不小于1.3x,設(shè)置好后點(diǎn)擊Snap拍攝。

 

4）拍攝后進(jìn)入Processing-Airyscan Processing.5.2D SR Processing-Input-Apply進(jìn)行圖像處理

 

4、圖像導(dǎo)出

 

可根據(jù)需要選擇Processing>lmage Export/MovieExport，對采集的圖像進(jìn)行導(dǎo)出。

 

5、關(guān)機(jī)流程

 

（1）將樣品移出，保存數(shù)據(jù)并關(guān)閉軟件。關(guān)閉電腦。

 

（2）清潔顯微物鏡，并將其轉(zhuǎn)到空位或低倍鏡上

 

（3）依照標(biāo)簽7-1順序，逆序關(guān)閉系統(tǒng)。

 

6、圖片分析處理

 

（1）優(yōu)勢：高分辨率，多通道熒光，圖片拼接以及組織切片層數(shù)掃描。

 

（2）圖3是由油鏡 63×拍攝的NF-κB移位入核：

 

圖3 NF-κB移位入核

 

（3）添加比例尺：點(diǎn)擊圖片下方【Graphics】，點(diǎn)擊紅色區(qū)域，自動添加比例尺。

 

圖4 添加比例尺

 

三、注意事項(xiàng)

 

1、選擇處于對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞密度最好在70%~80%左右，密度過大或過小都可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

 

2、注意要根據(jù)一抗的種屬來源選擇相應(yīng)的二抗，且從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都要避光。

 

3、選擇與目標(biāo)蛋白高度特異性結(jié)合的抗體，并確保一抗和二抗的種屬匹配，避免交叉反應(yīng)。同時(shí)，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適熒光標(biāo)記的抗體。

 

4、在固定與通透的過程中，固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性，針對磷酸化的抗體，不適合用甲醛。通透劑的濃度和時(shí)間也要根據(jù)細(xì)胞類型和抗原位置進(jìn)行優(yōu)化，避免過度通透導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。

 

5、封閉液的種類和濃度要選擇合適，封閉時(shí)間要足夠，以減少非特異性抗體結(jié)合

 

6、一抗和二抗的孵育時(shí)間和溫度要根據(jù)抗體說明書進(jìn)行優(yōu)化，孵育過程中要注意保持樣品的濕潤，避免干燥。同時(shí)，要注意控制抗體的濃度，避免過高或過低導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。

 

7、根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇合適的熒光染料，考慮其激發(fā)和發(fā)射波長，以確保熒光信號可以被檢測設(shè)備有效捕捉。同時(shí)，要注意熒光染料的穩(wěn)定性和淬滅問題，從加熒光二抗起，盡量避光操作，封片后應(yīng)盡早拍攝。

 

8、設(shè)置陽性對照組和陰性對照組，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。陽性對照組可以使用已知能誘導(dǎo)NF-κB入核的刺激劑處理細(xì)胞，陰性對照組則不添加任何刺激劑。

 

9、正確使用激光共聚焦顯微鏡，觀察時(shí)要注意區(qū)分細(xì)胞的自發(fā)熒光和特異性熒光信號，避免誤判。