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標(biāo)準(zhǔn)曲線的目的是定量，是每個(gè)檢測人員的必備技能。你所做的標(biāo)曲真的做好了嗎?RSD值、線性相關(guān)系數(shù)和線性方程如何？線性好與不好分別由于哪些原因造成的？是儀器、標(biāo)液，還是配制的問題？對比下文的一些點(diǎn)來找找原因吧！

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作要求

按GB/T 22554-2010《基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性校準(zhǔn)》推薦：

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍應(yīng)覆蓋正常操作條件下的被測量范圍；

2.標(biāo)準(zhǔn)樣品的組分盡量與被測樣品組分一致；

3.標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度值應(yīng)等距離的分布在被測量范圍；

4.標(biāo)準(zhǔn)樣品的個(gè)數(shù)至少應(yīng)有3個(gè)濃度；

5.每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)至少重復(fù)2次，這個(gè)重復(fù)是指從稀釋開始。

如果國家標(biāo)準(zhǔn)有相應(yīng)的濃度系列推薦，盡量按國家標(biāo)準(zhǔn)，如果你要偷懶，比如我要減少標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，至少要有理論標(biāo)準(zhǔn)支撐，比如至少要3個(gè)濃度。工作中我們經(jīng)常采用線性校準(zhǔn)，因?yàn)榫€性方程最為簡潔。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的作法

(1)標(biāo)準(zhǔn)液濃度的選擇：在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)液濃度選擇一般應(yīng)能包括待測樣品的可能變異最低與最高值，一般可選擇5種濃度。濃度差距最好是成倍增加或等級增加，并應(yīng)與被測液同樣條件下顯色測定。

(2)標(biāo)準(zhǔn)液的測定：在比色時(shí)，讀取光密度至少讀2-3次，求其平均值，以減少儀器不穩(wěn)定而產(chǎn)生的誤差。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制：一般常用的是光密度--濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

①用普通方格紙作圖。圖紙最好是正方形(長：寬=l：1)或長方形(長：寬=3 ：2)，以橫軸為濃度，縱軸為光密度，一般濃度的全距占用了多少格，光密度的全距也應(yīng)占用相同的格數(shù)。

在適當(dāng)范圍內(nèi)配制各種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，求其光密度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度位置向上延長，光密度位置向右延長、交點(diǎn)即為此座標(biāo)標(biāo)點(diǎn)。然后，將各坐標(biāo)點(diǎn)和原點(diǎn)聯(lián)成一條線，若符合Lambert-Beer氏定律，則系通過原點(diǎn)的直線。

②若各點(diǎn)不在一直線，則可通過原點(diǎn)，盡可能使直線通過更多點(diǎn)，使不在直線上的點(diǎn)盡量均勻地分布在直線的兩邊。

③標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制完畢以后，應(yīng)在座標(biāo)紙上注明實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的名稱，所使用比色計(jì)的型號和儀器編號、濾光片號碼或單色光波長以及繪制的日期、室溫。

④繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：一般應(yīng)作二次或三次以上的平行測定，重復(fù)性良好曲線方可應(yīng)用。

⑤繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線只能供以后在相同條件下操作測定相同物質(zhì)時(shí)使用。當(dāng)更換儀器、移動儀器位置、調(diào)換試劑及室溫有明顯改變時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線需重新繪制。

⑥標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)的標(biāo)度：從標(biāo)準(zhǔn)液的含量換算成待測液的濃度。

常見問題

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線需要人為的增加（0,0）點(diǎn)嗎？

不能。通常的標(biāo)準(zhǔn)系列多是配制0,1,2,3mg/L系列這樣的說法，沒做實(shí)驗(yàn)人為添加（0,0）很不妥，因?yàn)楹芏鄷r(shí)候0管進(jìn)入儀器可能也有響應(yīng)值，這也是我們考察試劑空白的一個(gè)重要步驟。這個(gè)0管在某些時(shí)候非常重要，比如全血鉛測定，我們采用牛血清來基體匹配標(biāo)準(zhǔn)系列，如果此時(shí)你用酸做空白或沒做實(shí)驗(yàn)人為添加（0,0），那你就很難做好標(biāo)準(zhǔn)曲線。所以標(biāo)準(zhǔn)曲線的0管也是做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的重要考慮點(diǎn)。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線需要減掉試劑空白來做嗎？

不需要。儀器測出來標(biāo)準(zhǔn)系列的響應(yīng)值可以減掉試劑空白或減掉0管的響應(yīng)值來做，工作中我們也常用0管來做儀器調(diào)零。其實(shí)沒有必要那么麻煩，即使空白或0管有響應(yīng)值，在構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，我們已經(jīng)認(rèn)為該響應(yīng)值就是0濃度，也就是扣除了這個(gè)空白的。

3.什么時(shí)候用Y=bX和二次曲線呢？

標(biāo)準(zhǔn)曲線我們通常采用的是Y=a+bX，曲線擬合完必須要做統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，且要做統(tǒng)計(jì)完備的線性檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)，然后再做a與0的差別檢驗(yàn)，如果a與0的統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異，你就可以考慮用Y=bX的擬合曲線，擬合出來后同樣做線性檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)，如果線性檢驗(yàn)合格（P<0.05）且失擬檢驗(yàn)合格（p>0.05）此時(shí)你就可以采用Y=bX。二次曲線的采用同樣是這樣的道理，如果你Y=a+bX時(shí)擬合不合格，你就考慮用Y=a+bX+cX2，同樣做失擬檢驗(yàn)，考察擬合的符合情況。如果Y=a+bX 和Y=a+bX+cX2都滿足擬合檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)合格，則采用Y=a+bX形式，這樣符合統(tǒng)計(jì)學(xué)上參數(shù)最少的統(tǒng)計(jì)簡潔性原則。

4.標(biāo)準(zhǔn)曲線去查含量時(shí)是先減空白信號算樣品含量還是先算出空白含量相減呢？

工作中我們常要減掉空白得到樣品含量，現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)方法有的推薦先算出空白含量，用樣品含量相減，也有推薦先用樣品信號減空白信號然后去標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量。而且這兩種算法常常差距很大。其實(shí)這種差距往往是低含量水平時(shí)才出現(xiàn)，在低含量水平通過標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量時(shí)，本身不確定度就很大。這兩種方法都可以。個(gè)人推薦先用樣品信號減空白信號然后去標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量，因?yàn)檫@樣出來的含量不確定度要小一些，而先算出空白含量再相減就增加了1次標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量時(shí)的不確定度，因?yàn)楹玫臏y量永遠(yuǎn)是不確定度小的測量。

5 如何做兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)?zāi)兀?/span>

1.先從原理上講：判斷兩條或多條標(biāo)準(zhǔn)曲線的差異，須檢驗(yàn)殘差，截距和斜率三項(xiàng)，分別有不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)，殘差用F檢驗(yàn)，截距和斜率采用較為復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)量。

2、從實(shí)際操作講：多用協(xié)方差分析檢驗(yàn)截距和斜率的差異，以SPSS為例：

①先重新整理數(shù)據(jù),將y2數(shù)據(jù)列加到y(tǒng)1下面,變成一個(gè)變量y;將x2數(shù)據(jù)列加到x1下面,變成一個(gè)變量x;然后再設(shè)定一個(gè)新的分組變量group,原來第1組值為1,第2組值為2。

②進(jìn)行協(xié)方差分析(第一步分析斜率是否無差異).Analyze->GeneralLinear Model->Univariate Dependent List:填入y—將y做為因變量 Fixed Factor:填入group Covaraites:填入x—將x做為協(xié)變量 Model:選Custom Model:填入 x groupx*group—注意如果變量填入順序不一樣,結(jié)果也會不一樣. Sum ofsquares下拉列表框:選TypeI 然后點(diǎn)擊ok,看結(jié)果里x*group這一行的Sig.P值,若大于0.05,則接受原假設(shè),即兩條回歸直線的斜率無差異,否則拒絕。

③再來進(jìn)行截距的無差異分析其實(shí)過程跟上面一樣,只是Model里去掉了x*group交叉項(xiàng).Analyze->GeneralLinear Model->Univariate Dependent List:填入y—將y做為因變量 Fixed Factor:填入group Covaraites:填入x—將x做為協(xié)變量 Model:選Custom Model:填入 x group—注意如果變量填入順序不一樣,結(jié)果也會不一樣. Sum of squares下拉列表框:選TypeI 點(diǎn)擊ok后,看group一行的Sig.P值,若P值大于0.05說明兩條回歸直線截距也無差異,若小于0.05說明截距是有差異的。

6 標(biāo)準(zhǔn)系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液體積取用中有效數(shù)字該如何寫呢？

標(biāo)準(zhǔn)溶液體積取用的有效數(shù)字跟你采用的體積量具有直接關(guān)系。比如說量取或準(zhǔn)確量取等字眼，10mL和10.0mL提示你要采用不同的量具。

當(dāng)我們使用某個(gè)量具完成某次體積取用后，讀數(shù)是按照量具的最小允差決定的，而最小允差是針對最小分度線而言的。

當(dāng)取用10mL體積時(shí)，如果用A級10mL的分度吸管，那么10.0mL應(yīng)該是確定的，因?yàn)樗姆侄染€為0.1mL。

當(dāng)取用1mL體積時(shí)，如果用A級1mL的分度吸管，那么1.00mL應(yīng)該是確定的，因?yàn)樗姆侄染€為0.01mL。

所以我個(gè)人意見，到底寫10.00還是10.0以最小分度線來確定，最小分度線以下的都為估讀。如果你認(rèn)為估讀也是有效數(shù)字的話，10.00mL也可以，因?yàn)榇藭r(shí)的容量允差為0.05mL，但1.000mL就沒有太大意義了，因?yàn)锳級1mL的分度吸管的容量允差已經(jīng)是0.008mL了。

7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)的有效數(shù)字該如何保留呢？

GB5750.3-20068.2.7項(xiàng)有如下規(guī)定：校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)只舍不入，保留到小數(shù)點(diǎn)后出現(xiàn)非9的一位，如0.99989→0.9998。如果小數(shù)點(diǎn)后都是9時(shí)，最多保留小數(shù)點(diǎn)后4位。

8 標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用同一濃度不同體積的進(jìn)樣來做嗎？

標(biāo)準(zhǔn)系列一般都是配制不同濃度，進(jìn)樣相同體積來做的（濃度法）。但實(shí)際工作中我們還用到同一濃度來進(jìn)樣不同體積的方式來做（體積法），濃度法與體積法的區(qū)別在于濃度法中與待測物質(zhì)存在的溶劑/待測物質(zhì)的比例與體積法不同。濃度法中溶劑的環(huán)境（體積）基本是一致的，這樣的好處就是濃度法在判斷溶劑（或溶劑中干擾物質(zhì)）和待測物質(zhì)的指認(rèn)上更加容易。體積法中干擾物質(zhì)也會隨標(biāo)準(zhǔn)系列增加，不容易實(shí)現(xiàn)待測物質(zhì)的指認(rèn)。從進(jìn)樣針，進(jìn)小體積時(shí)不確定度比較大，帶來的直接結(jié)果時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線不如濃度法容易做直。而且物理體積的限制，體積法不太容易實(shí)現(xiàn)較大跨度的濃度系列設(shè)置?？傊?，體積法和濃度法本質(zhì)上是一致的，但濃度法有：容易做好標(biāo)準(zhǔn)曲線，容易實(shí)現(xiàn)較大濃度跨度和容易實(shí)現(xiàn)待測物質(zhì)的指認(rèn)等優(yōu)點(diǎn)。

9 標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品是負(fù)值，如何報(bào)告結(jié)果呢？這種情況下我們一般選擇四種方式報(bào)告結(jié)果：未檢出，<檢出限，<定量限，<標(biāo)準(zhǔn)曲線第一點(diǎn)所推算的樣品濃度。

四種都有道理，實(shí)際區(qū)別是埋在四種選擇下面的結(jié)果報(bào)告人的風(fēng)險(xiǎn)。

未檢出的全部含義應(yīng)該是本實(shí)驗(yàn)室本儀器本方法未檢出，如果沒有這些界定，未檢出的歧義很多，而且沒有提供其它任何可用的信息。

所以建議學(xué)生一般不采用這種報(bào)告方法；

檢出限是定性檢出的標(biāo)志，它是跟空白的統(tǒng)計(jì)比較計(jì)算出來的。

每臺儀器，每次測定都有其檢出限，檢出限計(jì)算目前有兩大類計(jì)算方法：單濃度方法和校正設(shè)計(jì)法（Anal.Chem.1997,69:3069)，常規(guī)采用的單濃度方法需要額外的工作，所以現(xiàn)在趨向用校正設(shè)計(jì)法，既利用標(biāo)準(zhǔn)曲線直接計(jì)算檢出限，但檢出限I類和II類錯(cuò)誤皆控制在0.05。

定量限是可以定量檢出的標(biāo)志，其RSD定為10%，其II類錯(cuò)誤比檢出限小很多。<標(biāo)準(zhǔn)曲線第一點(diǎn)所推算的樣品濃度，是我們儀器比較可信的測定濃度?？傊瑘?bào)告<檢出限，<定量限，<標(biāo)準(zhǔn)曲線第一點(diǎn)所推算的樣品濃度所犯I類和II類錯(cuò)誤依次降低，但如果這個(gè)報(bào)告結(jié)果已經(jīng)超過你要判斷的限值，那么你的檢測就一點(diǎn)意義都沒有了。所以現(xiàn)在的檢測單位甚至直接報(bào)告小于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限值，從概率統(tǒng)計(jì)的角度講，它犯錯(cuò)誤的幾率最小，但又解決了客戶的檢測問題。

10 空白測出來是負(fù)值，該不該減呢？

空白代表你所選擇的空白對儀器響應(yīng)/信號的影響，當(dāng)然可能是正方向和負(fù)方向的影響，所以理論上講必須減掉空白。至于是先減空白信號，還是減空白測定值，按國家規(guī)定或參見4.4問題。

11 線性范圍（動態(tài)范圍）的最低點(diǎn)和最高點(diǎn)如何確定呢？

配制一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)，包括0濃度，從低濃度開始擬合當(dāng)擬合檢驗(yàn)出現(xiàn)P>0.05的最高的那個(gè)濃度點(diǎn)為止。有也經(jīng)驗(yàn)說當(dāng)加入的高濃度點(diǎn)在低濃度點(diǎn)構(gòu)建的直線方程推算的響應(yīng)超出±10%范圍。關(guān)于線性范圍的最低點(diǎn)應(yīng)該是0、檢出限或是定量限的問題，個(gè)人趨向最低點(diǎn)為0，因?yàn)榫€性范圍只是統(tǒng)計(jì)學(xué)上線性的表現(xiàn)，跟能否準(zhǔn)確定量是兩方面的問題。