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人體吸收、分布、代謝、排泄（hADME）研究主要目的有兩個(gè)：1）鑒定和定量外周血中的原型藥及代謝產(chǎn)物；2）定量表征藥物消除特征。

 

hADME起源

 

hADME與George de Hevesy最初提出并建立的同位素示蹤劑的使用有關(guān)，其本人并因此獲得了1943年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。Hevesy早期工作將放射性鉛（210Pb和212Pb）用于化學(xué)和生物學(xué)研究，實(shí)現(xiàn)了放射性元素作為示蹤劑的應(yīng)用。將放射性同位素，通常是氚（3H）或碳-14（14C）或穩(wěn)定同位素（2H、13C、15N、18O等）摻入?yún)⑴c化學(xué)反應(yīng)或生物轉(zhuǎn)化的底物或中間體中，可以追蹤標(biāo)記的中間體或產(chǎn)物，既可定性，又可用于定量。

 

Hevesy對示蹤劑的使用很快被其他人采用，并最終擴(kuò)展到代謝和生物化學(xué)的研究。比如使用14CO2和3H2O探索光合作用，使用穩(wěn)定和放射性同位素標(biāo)記的化合物確認(rèn)Krebs cycle，以及使用32P和35S確定遺傳物質(zhì)是DNA，而不是蛋白質(zhì)。

 

雖然3H于1934年就被發(fā)現(xiàn)，但其在核武器開發(fā)中的使用限制了其在20世紀(jì)40年代和50年代的可用性和研究用途。碳元素方面，早期的生化研究采用的是短半衰期（20.4分鐘）的11C。不過，1940年發(fā)現(xiàn)了長半衰期的14C（5730年），并在生化研究中得到了更廣泛的應(yīng)用。采用Berkeley輻射實(shí)驗(yàn)室獲得的14C進(jìn)行了[14C]二苯并蒽的放射性化合物合成，并于1948年首次發(fā)表了14C標(biāo)記二苯并蒽在動(dòng)物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄研究中的應(yīng)用。這項(xiàng)研究在收集和表征排泄物和膽汁中14C的消除方面與現(xiàn)代ADME研究相似。

 

14C標(biāo)記化合物的人體ADME研究最早是Alpen等人于1951年披露，研究的14C標(biāo)記水楊酸的代謝。不過，在那個(gè)年代，原型藥和代謝物的分離方法、鑒定方法和檢測方法比較受限。生物樣本主要收集的是外周血和尿液，很少關(guān)注糞便中的原型藥物及代謝產(chǎn)物。

 

很難確定放射性標(biāo)記ADME成為常規(guī)研究的具體時(shí)間，普遍認(rèn)為這個(gè)時(shí)間點(diǎn)在20世紀(jì)50年代初至中期。到了20世紀(jì)70年代初，hADME研究已經(jīng)非常普及。

 

20世紀(jì)50年代末氣相色譜質(zhì)譜法的發(fā)展，20世紀(jì)70年代和80年代出現(xiàn)了高效液相色譜法（HPLC），21世紀(jì)初出現(xiàn)了超高效液相色譜儀，使得藥物和代謝物的分辨率更高，分析速度更快。此外，液相色譜（LC）分離方法與熱噴霧界面和電噴霧界面結(jié)合，以及核磁共振儀器的改進(jìn)，對代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定產(chǎn)生了巨大影響。hADME研究中的樣品分析和代謝物結(jié)構(gòu)測定受益于分析方法和儀器的進(jìn)步。

 

標(biāo)準(zhǔn)ADME設(shè)計(jì)

 

人體ADME的設(shè)計(jì)在過去數(shù)十年基本沒有太大變化。臨床研究志愿者給予14C標(biāo)記化合物，其中的14C通常放置在代謝穩(wěn)定的位置，以避免放射性的丟失。14C的劑量需要足夠高，以保證液閃儀（LSC）可以對原型藥和代謝物的準(zhǔn)確定量，通常在40至100 μCi之間。給藥途徑與臨床擬用途徑一致，通常是口服。14C標(biāo)記藥物ADME通常是單次給藥，使用的制劑通常不是最終或商業(yè)化制劑，而是專門為本研究制備的溶液或混懸液。因此，獲得的藥代動(dòng)力學(xué)特征可能并不能精確模擬真實(shí)片劑或膠囊制劑。

 

在給臨床試驗(yàn)受試者（通常為4-8人）服用后，在設(shè)定的時(shí)間間隔內(nèi)收集尿液和糞便樣本。收集的持續(xù)時(shí)間根據(jù)估計(jì)的藥物及其相關(guān)物質(zhì)的排泄特點(diǎn)進(jìn)行預(yù)設(shè)，也可以通過實(shí)時(shí)分析樣本和數(shù)據(jù)進(jìn)行靈活設(shè)置。當(dāng)達(dá)到預(yù)定的回收率（通常為90%）或藥物相關(guān)物質(zhì)的排泄率降至預(yù)定閾值以下（如一天內(nèi)1%）時(shí)，受試者可以退出研究。LSC可以在短時(shí)間內(nèi)完成檢測，以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的及時(shí)決策，如樣本采集周期。血液樣本也被收集，用于測定總藥物相關(guān)物質(zhì)的藥代動(dòng)力學(xué)，并與原型藥的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行比較。

 

尿液的分析比較常規(guī)、簡單，從尿液中取出小份樣品，直接LSC檢測，再根據(jù)取出的體積占比，折算某給藥間隔內(nèi)總尿液放射性。所有給藥間隔尿液總放射性相加，再除以給藥總放射性，就是尿液排泄的藥物比例。糞便樣本操作起來有點(diǎn)復(fù)雜，因存在顆?；蛘哂猩镔|(zhì)，可能會(huì)干擾檢測，通常會(huì)將糞便樣本高溫?zé)蒀O2，再行測量。其它生物樣本的收集和檢測，如呼出的空氣、汗液，并不常見，但不排除有些藥物通過這些途徑排出體外，需根據(jù)具體情況決定是否收集和分析。

 

血漿也會(huì)進(jìn)行總放射性分析。當(dāng)然，有時(shí)用全血。血漿可以直接測量，全血?jiǎng)t需要做些預(yù)處理如勻漿或漂白等。在經(jīng)典的人體ADME研究中，原型藥物也會(huì)采用非放射性方法定量測定（常用的是HPLC-MS），獲得Cmax、Tmax、AUC、t1/2等參數(shù)，可以與放射性方法測定的相應(yīng)參數(shù)進(jìn)行比較。

 

除了吸收和排泄，還會(huì)對血漿、尿液和糞便勻漿中的代謝物譜進(jìn)行定量測定。為減少代謝物的損失，通常前處理比較簡單，采用簡單的液相提取，通過離心去除鹽和蛋白質(zhì)，蒸發(fā)含有藥物相關(guān)物質(zhì)的上清液，再重新復(fù)溶，然后進(jìn)行HPLC分析。整個(gè)樣品處理過程，總放射性的回收率應(yīng)為90%或更高，以增加特定代謝物未丟失的可信度。代謝物被色譜分離成離散的峰，這些峰可以通過LSC進(jìn)行定量（可以通過離線或在線兩種形式），同時(shí)將一部分HPLC洗脫液轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜儀，以獲得代謝物的結(jié)構(gòu)信息。最終實(shí)現(xiàn)代謝物的結(jié)果鑒定和定量分析。

 

當(dāng)然，關(guān)于代謝物檢測，并不是對每個(gè)樣本均進(jìn)行分析，無論血漿、尿液還是糞便，都會(huì)進(jìn)行樣本合并，對合并后的單一樣本進(jìn)行分析。需要注意的是，必須按比例考量每個(gè)樣本的體積/重量，以生成真正代表總排泄量的分析樣本。

 

新技術(shù)應(yīng)用—加速器質(zhì)譜技術(shù)（AMS）和核磁共振（NMR）

 

AMS技術(shù)是一種高靈敏度的核分析技術(shù)，出現(xiàn)在20世紀(jì)70年代，但直至過去10年，其大小和成本才開始滿足小型實(shí)驗(yàn)室的使用。相較于傳統(tǒng)的LSC，AMS的檢測靈敏度提高了多個(gè)數(shù)量級，直接的優(yōu)勢是可以降低給藥量，100-1000nCi即可。事實(shí)上，基于AMS的ADME研究中，血漿和排泄物樣本中的14C含量已經(jīng)很低，不再視為具有放射性。極低的電離輻射暴露對受試者沒有安全性風(fēng)險(xiǎn)，正因如此，用于進(jìn)行人體組織劑量估計(jì)的動(dòng)物定量全身放射自顯影研究（QWBA）不再是進(jìn)行人體ADME研究的先決條件。當(dāng)然，有利也有弊，AMS相較于LSC，樣品制備過程更久、更費(fèi)力、設(shè)備成本也更高。

 

14C標(biāo)記化合物需要專門制備樣品，時(shí)間可能長達(dá)幾個(gè)月，成本不菲，高則數(shù)十萬美元。氟存在于許多藥物中，與質(zhì)子相比，沒有內(nèi)源性含氟干擾。因此，氟核磁共振（F-NMR）可用于含氟藥物的ADME，不需要14C標(biāo)記。當(dāng)使用F-NMR進(jìn)行ADME研究時(shí)，樣品處理程序雖然不如LSC簡單，但比AMS有優(yōu)勢。與LSC和AMS相比，NMR的挑戰(zhàn)在于靈敏度較低，即使使用高頻儀器（>500 MHz），也需要對大量樣品進(jìn)行處理和濃縮才能可靠定量。Pearson等人于2019年首次報(bào)道了使用F-NMR對leniolisib進(jìn)行hADME研究。

 

下表比較了傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)放射性檢測、AMS和NMR不同技術(shù)路線用于hADME研究的特點(diǎn)。

 

 

動(dòng)物ADME研究

 

目前常見做法是，在進(jìn)行hADME研究之前，開展至少一項(xiàng)放射性標(biāo)記的動(dòng)物ADME研究。動(dòng)物ADME研究的路線通常是先開展大鼠的ADME研究，然后再進(jìn)行第二個(gè)毒理學(xué)種屬的ADME試驗(yàn)。隨后進(jìn)行QWBA，該試驗(yàn)可用于組織劑量計(jì)算，從而為后續(xù)hADME研究的放射性劑量提供依據(jù)。另外，動(dòng)物ADME研究還可以為hADME研究提供其它支持，如基質(zhì)的提取技術(shù)、分離代謝物的色譜系統(tǒng)和代謝物結(jié)構(gòu)表征。而且，動(dòng)物研究可以更具侵入性，例如膽汁插管大鼠試驗(yàn)。當(dāng)然，動(dòng)物ADME特征可能并不能完全反映人體情況。

 

2012年，Obach等人引發(fā)了一場爭論，主題是關(guān)于動(dòng)物放射性標(biāo)記的物質(zhì)平衡和排泄研究是否仍然必要。爭論的核心是，相較于對動(dòng)物的詳盡研究，對人類代謝物的早期了解，可能更為重要。而利用現(xiàn)代技術(shù)進(jìn)行的早期hADME研究（不遲于ⅡA期）是可以鑒定主要的人體代謝物的?？梢允褂梅欠派湫詷?biāo)記的方法在臨床樣本和毒理學(xué)樣本之間進(jìn)行初步比較，以評估人體代謝物在動(dòng)物中是否足以覆蓋。當(dāng)然，有些情況需要在動(dòng)物中進(jìn)行放射性標(biāo)記的物質(zhì)平衡研究（比如評估一種可能對該動(dòng)物種屬造成毒性的種屬特異性代謝物，與人體無關(guān)）。White等人（2013）認(rèn)為，在至少一個(gè)種屬中進(jìn)行放射性標(biāo)記的物質(zhì)平衡研究對藥物開發(fā)至關(guān)重要，因?yàn)檫@是預(yù)期監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求的申報(bào)資料的一部分，且這些研究可以為后續(xù)處理人體樣本提供參考。

 

目前，爭議依然存在。由歐洲制藥工業(yè)協(xié)會(huì)聯(lián)合會(huì)（EFPIA）藥物代謝和藥代動(dòng)力學(xué)（DMPK）網(wǎng)絡(luò)贊助的藥企聯(lián)盟，組成了一個(gè)工作組，發(fā)表了一篇白皮書（Young et al., 2023），其中寫到，工業(yè)界廣為接受的觀點(diǎn)是放射性研究不應(yīng)作為默認(rèn)的“check boxes”研究內(nèi)容，即不是所有藥物的默認(rèn)勾選項(xiàng)，而要基于case-by-case分析。最近，abrocitinib被批準(zhǔn)用于臨床，本品并未在動(dòng)物中開展任何放射性標(biāo)記的排泄研究，只進(jìn)行了hADME和大鼠QWBA研究。與下圖箭頭下方的路線一致。下圖是該白皮書給出的current general process，paradigm shift in process，圖中標(biāo)識(shí)了hADME不同試驗(yàn)開展的時(shí)間點(diǎn)。箭頭上面是目前用的比較多的hADME路線，即主流路線。箭頭下面則是白皮書提出的新的human first/human only變化。藍(lán)色為冷藥試驗(yàn)，紅色為放射性藥物研究。二者最大的區(qū)別是，箭頭下方不需要嚙齒類和非嚙齒類14C-ADME研究，更依賴于對冷藥代謝產(chǎn)物的鑒定，解決代謝產(chǎn)物安全性相關(guān)的問題。

 

人體ADME研究重要性

 

在hADME研究中，排泄物的主要作用之一是研究物質(zhì)平衡。物質(zhì)平衡對有效性和安全性的支持有限，其主要目的是為藥物清除提供支持和信心。例如，低回收率可能表明有生物樣本遺漏或不完整，藥物依然在體內(nèi)，或者藥物或代謝物從呼出的空氣中消除。FDA在《Clinical Pharmacology Considerations for Human Radiolabeled Mass Balance Studies Guidance for Industry》指出，回收率至少為90%。如果不符合這一標(biāo)準(zhǔn)，需提供“充分理由”。

 

大多數(shù)藥物是通過以下一種或多種機(jī)制消除：1）小腸中的代謝/轉(zhuǎn)運(yùn)；2）肝臟代謝/轉(zhuǎn)運(yùn)；3）腎小球?yàn)V過和腎小管分泌。如果藥物消除路徑出現(xiàn)損傷，會(huì)改變藥物的藥代動(dòng)力學(xué)行為，甚至需要調(diào)整藥物的給藥劑量。肝、腎損傷患者調(diào)整劑量需要考量的因素之一就是每個(gè)消除路徑的占比，而這一信息就來自hADME研究。

 

藥物在人體中的代謝譜及代謝產(chǎn)物濃度的測定具有重要意義，可以為體外、動(dòng)物和其他臨床研究提供更多信息。代謝物譜的測定對于化合物是否需要開展代謝產(chǎn)物安全性評價(jià)也是需要的。對于人體代謝比例超過10%的代謝產(chǎn)物，且動(dòng)物體內(nèi)沒有或暴露量不能覆蓋的情況，根據(jù)FDA代謝產(chǎn)物安全性評價(jià)指導(dǎo)原則，需要補(bǔ)充開展非臨床安全性研究。另外，有些代謝產(chǎn)物是具有活性的，對藥效也有貢獻(xiàn)。除了藥理學(xué)活性，代謝產(chǎn)物可能對藥物代謝酶或轉(zhuǎn)運(yùn)體產(chǎn)生與原型藥不一樣的作用。所以，hADME中對代謝產(chǎn)物濃度和結(jié)構(gòu)的研究可以提供很多數(shù)據(jù)，為體外或臨床藥物相互作用研究提供支持。下圖比較直觀的展示了hADME研究如何支持進(jìn)一步體外、動(dòng)物和其它臨床研究的。

 

 

人體ADME研究的開展節(jié)點(diǎn)

 

有些人依然認(rèn)為hADME研究在藥物開發(fā)過程中可以事后補(bǔ)充開展，即等其它研究完成后再行開展，開展節(jié)點(diǎn)盡可能的往后推遲。其中一部分原因是Ⅱ期臨床具備比較高的失敗率，再加上hADME研究費(fèi)用不菲，想等Ⅱ期臨床完成后再行開展。但考慮到DDI風(fēng)險(xiǎn)、代謝產(chǎn)物安全性等問題，hADME研究節(jié)點(diǎn)應(yīng)盡量提前。不同監(jiān)管機(jī)構(gòu)也給出了各自的答案。

 

2024年1月，NMPA頒布的《放射性標(biāo)記人體物質(zhì)平衡研究技術(shù)指導(dǎo)原則》指出，應(yīng)合理安排放射性標(biāo)記人體物質(zhì)平衡研究的開展時(shí)機(jī)，鼓勵(lì)在藥物臨床開發(fā)的早期進(jìn)行放射性標(biāo)記人體物質(zhì)平衡研究，以盡早獲得必要的信息以支持藥物研發(fā)總體計(jì)劃，通常建議在確證性臨床研究開始前完成。

 

2024年5月頒布的ICH M12《藥物相互作用研究》指導(dǎo)原則規(guī)定，通常應(yīng)在III期研究開始前獲得物質(zhì)平衡研究的結(jié)果。根據(jù)物質(zhì)平衡研究和體外研究的結(jié)果，應(yīng)考慮使用指針酶強(qiáng)抑制劑和誘導(dǎo)劑進(jìn)行臨床研究，以確認(rèn)主要代謝途徑，并確定具有臨床意義的DDI風(fēng)險(xiǎn)。

 

2024年7月，F(xiàn)DA在《Clinical Pharmacology Considerations for Human Radiolabeled Mass Balance Studies Guidance for Industry》指出，物質(zhì)平衡研究應(yīng)該早點(diǎn)開展，最遲應(yīng)在晚期臨床開始前完成。FDA認(rèn)為：1）物質(zhì)平衡研究可以提供代謝和排泄途徑相關(guān)信息。這些信息與其他體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)一起可以為DDI研究提供支持；2）鑒定應(yīng)進(jìn)行非臨床安全性評估的代謝物；3）指導(dǎo)腎和/或肝損傷研究；4）避免入組時(shí)不同腎功能和/或肝功能患者的排除，或?yàn)榘踩院陀行耘R床試驗(yàn)中這類患者的用藥劑量提供信息。

 

上文提及的白皮書也提到，各公司對hADME各項(xiàng)研究的開展時(shí)間節(jié)點(diǎn)看法不一，僅考慮在合適的時(shí)間開展。當(dāng)然，通常也不會(huì)在首次人體臨床研究中開展，畢竟制備符合GMP級別放射性標(biāo)記物料成本是非常高的。傳統(tǒng)做法是在臨床Ⅰ期開展冷藥人體代謝產(chǎn)物鑒定、嚙齒和非嚙齒類14C-ADME及大鼠QWBA研究，Ⅱ期臨床階段開展人體14C-ADME研究，這也是當(dāng)前的主流做法。隨著新技術(shù)和新觀念的出現(xiàn)，已經(jīng)有企業(yè)開始嘗試新的思路，前文已有提及，不再贅述。