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間接競爭ELISA是一種基于抗原-抗體特異性結(jié)合的免疫檢測技術(shù)，用于檢測樣品中微量的小分子抗原或半抗原。

在該實(shí)驗(yàn)中，先將已知抗原包被在酶標(biāo)板的微孔表面，然后加入待測樣品和一定量的抗體。如果樣品中含有目標(biāo)小分子（抗原），這些小分子會(huì)與包被在板上的抗原競爭有限的抗體結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制抗體與包被抗原的結(jié)合。接著加入酶標(biāo)二抗，與結(jié)合在包被抗原上的抗體結(jié)合，通過酶催化底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色的深淺來定量分析樣品中目標(biāo)小分子的含量。

由于樣品中目標(biāo)小分子的量與最終的顏色信號(hào)成反比，所以通過測量吸光度值可以間接反映出樣品中目標(biāo)小分子的濃度。 

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1、試劑選擇

（1）包被抗原：選擇具有良好免疫原性和特異性的抗原，它將作為固相載體上的捕獲分子，決定著整個(gè)實(shí)驗(yàn)的特異性和靈敏度。因此盡量使用高純度的抗原，可通過親和層析、離子交換層析等方法純化。如果是自己制備的抗原，要確保其結(jié)構(gòu)完整，避免變性。例如，對(duì)于蛋白類抗原，可使用SDS-PAGE和Western blot來鑒定其純度和分子量。保存抗原時(shí)，根據(jù)其穩(wěn)定性選擇合適的保存條件，一般在-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融。

（2）抗體是間接競爭ELISA的核心試劑，與抗原的親和力和特異性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此可以使用單克隆抗體或多克隆抗體。單克隆抗體特異性強(qiáng)，批間差異??；多克隆抗體可能具有更好的親和力，但特異性相對(duì)稍弱。選擇時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求權(quán)衡。保存抗體時(shí)，遵循供應(yīng)商的建議，一般在4℃短期保存或-20℃長期保存，避免反復(fù)凍融。可將抗體分裝成小份，使用時(shí)取出一份，減少因反復(fù)凍融導(dǎo)致的活性下降。

（3）酶標(biāo)二抗：酶標(biāo)二抗與一抗結(jié)合，通過酶的催化作用產(chǎn)生可檢測的信號(hào)。選擇與一抗來源物種相匹配的酶標(biāo)二抗，如一抗是小鼠來源的，可選擇抗小鼠的酶標(biāo)二抗。確保二抗的工作濃度經(jīng)過優(yōu)化，可通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳濃度。購買高質(zhì)量的酶標(biāo)二抗，檢查其保質(zhì)期和保存條件，通常在4℃保存，并注意避免光照，因?yàn)橐恍┟福ㄈ鏗RP）對(duì)光敏感。

2、耗材準(zhǔn)備

（1）酶標(biāo)板：作為反應(yīng)的固相載體，其質(zhì)量會(huì)影響抗原包被效果和實(shí)驗(yàn)背景信號(hào)。優(yōu)先選擇質(zhì)量可靠的品牌，如Costar、Nunc等。不同類型的酶標(biāo)板（如聚苯乙烯、聚氯乙烯）可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響，一般使用聚苯乙烯的高吸附板進(jìn)行蛋白包被。在使用前檢查酶標(biāo)板是否有損壞或污染，可通過肉眼觀察或用蒸餾水清洗后檢測吸光度來判斷。

（2）移液器和吸頭：準(zhǔn)確的加樣對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。使用經(jīng)過校準(zhǔn)的移液器，定期檢查和校準(zhǔn)其準(zhǔn)確性。使用合適量程的移液器，避免超量程使用。選擇與移液器匹配的高質(zhì)量吸頭，確保吸頭無RNase、DNase和內(nèi)毒素，防止污染。 

二、實(shí)驗(yàn)操作

1、包被：將抗原固定在酶標(biāo)板的孔底，為后續(xù)與抗體的結(jié)合提供結(jié)合位點(diǎn)。一般使用碳酸鹽緩沖液（pH9.6）或PBS緩沖液（pH7.4）作為包被緩沖液，將抗原稀釋至合適濃度（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，一般為0.5~10μg/mL）。每孔加入100μL抗原溶液，4℃過夜或37℃孵育2~4小時(shí)。包被后，用洗滌液（一般是含0.05%Tween-20的PBS）洗滌3~5次，以去除未結(jié)合的抗原。可以使用酶標(biāo)儀檢測OD值，判斷包被效果，一般OD值在0.8~1.2之間較為理想。

2、封閉：封閉未被抗原占據(jù)的酶標(biāo)板表面，減少非特異性吸附。常用的封閉劑有牛血清白蛋白（BSA）、脫脂奶粉等。使用1%~5%BSA或5%脫脂奶粉的PBS溶液，每孔加入200μL，37℃孵育1~2小時(shí)或4℃過夜。封閉后徹底洗滌，確保去除未結(jié)合的封閉劑，以免影響后續(xù)的反應(yīng)。

3、競爭反應(yīng)：在樣品和已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品中加入一抗，使它們競爭與包被抗原結(jié)合，樣品中的目標(biāo)分子會(huì)與標(biāo)準(zhǔn)品競爭結(jié)合抗體，從而反映樣品中目標(biāo)分子的濃度。準(zhǔn)備一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，涵蓋預(yù)期的樣品濃度范圍。同時(shí)加入適量的一抗，一抗?jié)舛雀鶕?jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。一抗孵育時(shí)間和溫度可根據(jù)抗體說明書和預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整，一般37℃孵育1~2小時(shí)或室溫孵育2~4小時(shí)。包括陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和樣品孔，每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)多個(gè)復(fù)孔，以提高結(jié)果的可靠性。

4、酶標(biāo)二抗孵育：使酶標(biāo)二抗與一抗結(jié)合，為后續(xù)顯色反應(yīng)做準(zhǔn)備。使用含0.05%Tween-20的PBS稀釋酶標(biāo)二抗，稀釋倍數(shù)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，一般為1:5000~1:20000。每孔加入100μL酶標(biāo)二抗溶液，37℃孵育1小時(shí)左右，然后充分洗滌，去除未結(jié)合的二抗。

5、顯色和終止原理：通過酶催化底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，終止反應(yīng)后測量吸光度，反映目標(biāo)分子的含量。若使用HRP標(biāo)記的二抗，常用的顯色劑是TMB底物，加入100μL，在室溫或37℃避光顯色10~30分鐘，至顏色達(dá)到一定強(qiáng)度。使用2M硫酸終止反應(yīng)，每孔加入50μL，終止反應(yīng)后立即在酶標(biāo)儀上讀取450nm（或450/630nm雙波長）處的吸光度。

三、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制原理：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和相應(yīng)的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于定量分析樣品中的目標(biāo)分子濃度。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，使用軟件（如GraphPadPrism、Excel）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通常使用四參數(shù)邏輯曲線（4PL）擬合，該曲線能較好地?cái)M合間接競爭ELISA的數(shù)據(jù)。檢查曲線的擬合度（R²值），一般要求R²>0.95，確保曲線的可靠性。

2、結(jié)果分析原理：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中目標(biāo)分子的濃度。將樣品的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣品中目標(biāo)分子的濃度。對(duì)于超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的樣品，需要稀釋或濃縮后重新檢測。分析數(shù)據(jù)時(shí)，計(jì)算樣品濃度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，評(píng)估實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。對(duì)于多組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以使用統(tǒng)計(jì)分析軟件（如SPSS）進(jìn)行組間比較。 

四、常見問題及解決方法

1、高背景信號(hào)可能原因及解決方法

（1）封閉不充分：增加封閉劑的濃度或延長封閉時(shí)間，優(yōu)化封閉條件。

（2）洗滌不徹底：增加洗滌次數(shù)或延長洗滌時(shí)間，確保洗滌液完全覆蓋孔底，避免殘留的試劑影響后續(xù)反應(yīng)。

（3）酶標(biāo)二抗?jié)舛冗^高：降低二抗?jié)舛龋匦逻M(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2、低信號(hào)強(qiáng)度或無信號(hào)可能原因及解決方法

（1）抗原或抗體失活：檢查試劑的保存條件和有效期，使用新的試劑重新實(shí)驗(yàn)。

（2）包被效果不好：優(yōu)化包被抗原的濃度和包被條件，如調(diào)整包被緩沖液、時(shí)間和溫度。

（3）顯色時(shí)間過短：適當(dāng)延長顯色時(shí)間，但要避免過度顯色導(dǎo)致顏色過深，難以準(zhǔn)確測量。