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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2025-02-13 08:48
摘要
遺傳毒性試驗(yàn)是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要組成部分，主要用于藥物早期致癌性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。近年來(lái)，新靶點(diǎn)和創(chuàng)新藥效結(jié)構(gòu)的藥物大量涌現(xiàn)，遺傳毒性或致癌性結(jié)果呈陽(yáng)性的創(chuàng)新藥物數(shù)量大幅增加。然而，有研究顯示細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames)結(jié)果為陽(yáng)性的化合物中約1/3為非致癌物。本文回顧了致突變性與致癌性風(fēng)險(xiǎn)間的關(guān)聯(lián)，Ames試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的原因及當(dāng)前國(guó)際上對(duì)Ames試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的藥物的監(jiān)管要求，總結(jié)了可供選擇的后續(xù)體內(nèi)試驗(yàn)方法，并提出當(dāng)藥物在非臨床安全性評(píng)價(jià)中Ames試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)的評(píng)價(jià)思路和機(jī)制研究策略，為藥物研發(fā)及評(píng)價(jià)提供借鑒。
【關(guān)鍵詞】 Ames試驗(yàn)；陽(yáng)性結(jié)果；后續(xù)試驗(yàn)；轉(zhuǎn)基因嚙齒動(dòng)物；Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)；下一代測(cè)序
遺傳物質(zhì)損傷與腫瘤的形成存在一定關(guān)聯(lián)。近年來(lái)，新靶點(diǎn)和創(chuàng)新藥效結(jié)構(gòu)的藥物大量涌現(xiàn)，遺傳毒性或致癌性結(jié)果呈陽(yáng)性的創(chuàng)新藥物數(shù)量大幅增加?；仡櫺晕墨I(xiàn)認(rèn)為，遺傳物質(zhì)致斷裂性風(fēng)險(xiǎn)通常與受試物的直接毒性有關(guān)[1]，染色體或DNA的斷裂性與劑量存在一定關(guān)聯(lián)，可通過(guò)降低暴露量而避免染色體損傷風(fēng)險(xiǎn)。然而，致突變性作用則無(wú)劑量效應(yīng)相關(guān)性，不可修復(fù)的突變形成后，可在不斷復(fù)制過(guò)程中逐漸發(fā)展為腫瘤。在美國(guó) 《醫(yī)師案頭參考(1999)》 清單列出的 352 個(gè)非抗癌藥物中，29%至少有一項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)為陽(yáng)性，201種藥品的標(biāo)簽中注明了遺傳毒性和致癌性結(jié)果為陽(yáng)性，38%的致癌性數(shù)據(jù)為陽(yáng)性，8.3%的細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames 試驗(yàn))結(jié)果為陽(yáng)性[2]。又如，蒽醌類(lèi)[3]和黃酮類(lèi)[4]等中藥中的常見(jiàn)成分Ames試驗(yàn)結(jié)果也為陽(yáng)性，該類(lèi)成分在我國(guó)已有上千年的服用歷史。由此引發(fā)了以下兩個(gè)問(wèn)題：①當(dāng)前在監(jiān)管領(lǐng)域常用的遺傳毒性試驗(yàn)方法是否可以科學(xué)地對(duì)創(chuàng)新藥物的人體致癌性風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)？②A(yíng)mes試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性的創(chuàng)新藥物應(yīng)采取怎樣的評(píng)價(jià)策略？
本文聚焦細(xì)菌致突變性數(shù)據(jù)與致癌性風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)，綜述了Ames試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的原因，并提出了Ames試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的后續(xù)研究策略，為藥物遺傳毒性研究和監(jiān)管提供參考。
1、致突變性與致癌性
基因突變可增加人類(lèi)患癌和遺傳性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)健康產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。Hermann Muller最早于1927年報(bào)道了暴露于X射線(xiàn)的果蠅會(huì)產(chǎn)生新的遺傳性狀，證明了暴露于環(huán)境因素會(huì)改變生物體的基因組成[5]。自1953年DNA結(jié)構(gòu)的發(fā)表及隨后DNA聚合酶的描述，逐漸將環(huán)境暴露與突變和遺傳變化聯(lián)系起來(lái)[6]。20世紀(jì)70年代中期，通過(guò)嚙齒動(dòng)物致癌性研究數(shù)據(jù)表明大多數(shù)已知誘變劑均具有致癌性。
致癌物按照作用機(jī)制可分為對(duì)DNA造成直接損傷的遺傳毒性致癌物和不直接造成DNA損傷的非遺傳毒性致癌物，即表觀(guān)遺傳性致癌物。其中遺傳毒性致癌物的致突變性作用，理論上沒(méi)有閾值[7]。50多年來(lái)，致癌性與致突變性之間的密切關(guān)聯(lián)一直是遺傳毒性研究的驅(qū)動(dòng)力。突變導(dǎo)致癌癥重要的第一步是DNA損傷，致癌物可以導(dǎo)致DNA加合物的形成，誘發(fā)DNA的其他修飾，也會(huì)導(dǎo)致 DNA 鏈交聯(lián)、斷裂和染色體的缺失重排[8]。非遺傳毒性致癌物無(wú)致突變性，但有閾值反應(yīng)，在一定范圍內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生不良影響，主要以DNA甲基化或組蛋白乙?；瘍煞N方式影響某些基因的表達(dá)。本文聚焦致突變性和致癌性的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。
2、Ames試驗(yàn)
Ames 試驗(yàn)由 Bruce N. Ames 于 1973 年首次報(bào)道，當(dāng)前已成為全球范圍內(nèi)用于化學(xué)品和藥物致突變性風(fēng)險(xiǎn)初步篩選的首選試驗(yàn)方法。該方法基于營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門(mén)氏菌(如TA97a、TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535 和 TA1537 等)和大腸桿菌(WP2和WP2urvA)開(kāi)展。在誘變劑作用下，缺陷基因反向突變，使細(xì)菌自主合成必需氨基酸并在培養(yǎng)基中形成可見(jiàn)菌落，從而通過(guò)菌落計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)受試物的致突變性風(fēng)險(xiǎn)。鑒于A(yíng)mes試驗(yàn)簡(jiǎn)單靈活、成本效益好，并建立了經(jīng)驗(yàn)證的大型數(shù)據(jù)庫(kù)，當(dāng)前已基于化合物的結(jié)構(gòu)特征、Ames 試驗(yàn)數(shù)據(jù)和計(jì)算拓展分析技術(shù)開(kāi)發(fā)了多種體外致突變性風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)模型。如Hansen 等[9]構(gòu)建的包含6500種化學(xué)物質(zhì)以及沙門(mén)氏菌檢測(cè)數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)信息的基準(zhǔn)數(shù)據(jù)集，以及Vian等[10]開(kāi)發(fā)的可評(píng)估S9組分代謝活化對(duì)Ames計(jì)算機(jī)模型的影響的預(yù)測(cè)模型等。
2.1 Ames試驗(yàn)陽(yáng)性藥物的監(jiān)管現(xiàn)狀
通常Ames試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性的化合物被視為存在體內(nèi)致突變性風(fēng)險(xiǎn)或致癌性風(fēng)險(xiǎn)。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food andDrug Administration，F(xiàn)DA)允許Ames試驗(yàn)陽(yáng)性藥物在健康受試者中進(jìn)行單次給藥試驗(yàn)。某些監(jiān)管機(jī)構(gòu)則允許超過(guò)單次的使用，如英國(guó)藥品和健康產(chǎn)品管理局(Medicines and HealthcareProducts Regulatory Agency，MHRA)認(rèn)為在健康受試者中使用存在遺傳毒性的受試物時(shí)需要提供具體的理由，當(dāng)理由充分(如基于毒理學(xué)關(guān)注閾值的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估數(shù)據(jù)、藥物半衰期數(shù)據(jù)、人臨床擬用劑量范圍等)時(shí)，可在臨床給予單劑量的 Ames 陽(yáng)性藥物。如無(wú)充分的理由，單劑量給予周期不可超過(guò)1周。此外，人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(International Council forHarmonization of Technical Requirement for Pharmaceuticalsfor Human Use，ICH)發(fā)布的 ICH M3(R2)指導(dǎo)原則[11]指出如藥物無(wú)警示結(jié)構(gòu)，可以100 μg/d的劑量分5次給予，該劑量為臨床試驗(yàn)中使用藥理活性劑量的1/1 000~1/10以下。德國(guó)聯(lián)邦藥品 和 醫(yī) 療 器 械 機(jī) 構(gòu) (Bundesinstitut für Arzneimittel undMedizinprodukte，BfArM)也允許在健康受試者中使用微劑量的Ames 陽(yáng)性藥物。然而，加拿大衛(wèi)生部則認(rèn)為如果沒(méi)有后續(xù)研究證明該類(lèi)藥物在體內(nèi)無(wú)致突變性，則不允許其在健康受試者中進(jìn)行臨床試驗(yàn)。日本監(jiān)管部門(mén)也不允許在健康受試者中使用Ames陽(yáng)性藥物。中國(guó)自加入ICH以來(lái)，對(duì)Ames陽(yáng)性藥物的監(jiān)管主要參考ICH指導(dǎo)原則。
2.2 Ames試驗(yàn)陽(yáng)性藥物的機(jī)制探索
Ames試驗(yàn)的陽(yáng)性結(jié)果與致癌性風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，但Ames試驗(yàn)結(jié)果也可能是由多種因素影響產(chǎn)生的假陽(yáng)性結(jié)果，因此對(duì)Ames陽(yáng)性結(jié)果的機(jī)制探索十分重要。
2.2.1 雜質(zhì)
Ames試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果可能由低濃度的致突變性雜質(zhì)引起，這些雜質(zhì)在ICH M7(R2)指導(dǎo)原則中屬于1類(lèi)和2類(lèi)雜質(zhì)。對(duì)于已知具有致突變性和致癌性的1類(lèi)雜質(zhì)，首先考慮去除，如果無(wú)法去除，則應(yīng)建立基于未觀(guān)察到作用水平(noobserved effect level，NOEL)致癌性數(shù)據(jù)的限度數(shù)值。監(jiān)管評(píng)估的常規(guī)方式是根據(jù)致癌性劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)采用線(xiàn)性低劑量外推法，即以誘導(dǎo)50%腫瘤發(fā)生率的劑量(TD50)的五萬(wàn)分之一為攝入量，將腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)控制在十萬(wàn)分之一。對(duì)于已知致突變性但致癌性未知的2類(lèi)雜質(zhì)，如存在閾值相關(guān)機(jī)制，以每日允許暴露量(permitted daily exposure，PDE)求限度值；如無(wú)閾值相關(guān)機(jī)制的證據(jù)，根據(jù)毒理學(xué)關(guān)注閾值(threshold of toxicologicalconcern，TTC)確立限度。如2007年在抗HIV藥物Viracept中發(fā)現(xiàn)了遺傳毒性雜質(zhì)EMS，Gocke 等[12]開(kāi)展多劑量的轉(zhuǎn)基因小鼠致突變性試驗(yàn)，并結(jié)合微核試驗(yàn)和組織中加合物檢測(cè)，得到25 mg/(kg·d)為EMS致突變效應(yīng)的起始閾值，且該劑量下重復(fù)給藥無(wú)蓄積效應(yīng)。Viracept 中 EMS 的人體最大暴露劑量為0.055 mg/(kg·d)，遠(yuǎn)低于致突變作用閾值。故認(rèn)為使用Viracept的患者不會(huì)因接觸 EMS而出現(xiàn)任何額外的毒理不良反應(yīng)。
但有些高致突變致癌物被稱(chēng)為“關(guān)注隊(duì)列”，即使攝入量低于TTC，理論上仍會(huì)具有高致癌風(fēng)險(xiǎn)，主要包括黃曲霉毒素樣化合物、N-亞硝基化合物和烷基氮氧化合物。其中N-烷基亞 硝 胺 例 如 N-亞 硝 基 二 甲 胺 (NDMA) 和 N-亞 硝 基 二 乙 胺(NDEA)，是已知的對(duì)大鼠具有遺傳毒性的致癌物質(zhì)。這類(lèi)物質(zhì)具有非線(xiàn)性劑量反應(yīng)和實(shí)際閾值，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估不能使用TTC。遵循ICH建議，Johnson等[13]使用已發(fā)表的嚙齒動(dòng)物癌癥生物測(cè)定和體內(nèi)致突變性數(shù)據(jù)計(jì)算NDMA對(duì)癌變和突變的PDE分別為每人 6.2 和 0.6 μg/d，NDEA 對(duì)癌變和突變的 PDE 分別為每人 2.2和0.04 μg/d，均高于簡(jiǎn)單線(xiàn)性外推得出的可接受的每日攝入量(NDMA為96 ng，NDEA為26.5 ng)。這為使用基準(zhǔn)方法的PDE計(jì)算提供了更可靠的暴露限值評(píng)估并且可以更好地告知患者的風(fēng)險(xiǎn)。
2.2.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)
藥物的結(jié)構(gòu)成分之間相互干擾可能產(chǎn)生毒性，從而使 Ames 結(jié)果為陽(yáng)性。“警示結(jié)構(gòu)”一詞由 Ashby[14]在1985年定義致癌性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)時(shí)引入，它是與化學(xué)物質(zhì)的致癌和致突變特性相關(guān)的分子結(jié)構(gòu)或活性基團(tuán)，不僅對(duì)潛在致癌物的分類(lèi)非常有幫助，而且對(duì)理解遺傳毒性機(jī)制也很重要。Perez-Garrido 等[15]提出了一系列針對(duì)致突變性的警示結(jié)構(gòu)，表明致突變性與疏水性和分子體積之間存在相關(guān)性，創(chuàng)建的模型一致性為86%，正確分類(lèi)了95%的致突變物質(zhì)。Amberg等[16]證明在使用DMSO 作為媒介的Ames 試驗(yàn)中，產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果的18種?；蚧酋｛u化學(xué)品中有15種在使用水為媒介時(shí)產(chǎn)生陰性結(jié)果。這可能是由于酰基或磺酰鹵在DMSO中進(jìn)行?；a(chǎn)生鹵代甲基硫醚，也可能是在水中分別水解為非誘變碳酸和鹵化氫或磺酸和鹵化氫。由此可以得出?；蚧酋｛u是Ames致突變性的警示結(jié)構(gòu)。
國(guó)際上提出采用警示結(jié)構(gòu)作為區(qū)分普通雜質(zhì)和遺傳毒性雜質(zhì)的重要依據(jù)，這一概念也成為遺傳毒性警示結(jié)構(gòu)以及定量構(gòu)效關(guān)系(quantitative structure activity relationship，QSAR)模型的基礎(chǔ)。ICH M7 指南允許在試驗(yàn)數(shù)據(jù)不足時(shí)使用計(jì)算機(jī) QSAR方法來(lái)預(yù)測(cè)細(xì)菌致突變性，使用兩種互補(bǔ)的方法即基于專(zhuān)家規(guī)則和基于統(tǒng)計(jì)搜索是否存在警示結(jié)構(gòu)是將雜質(zhì)分類(lèi)為3、4或5類(lèi)的第一步。在基于規(guī)則的系統(tǒng)中，定性預(yù)測(cè)基于化學(xué)品的警示結(jié)構(gòu)，因?yàn)榫窘Y(jié)構(gòu)周?chē)碾娮用芏群涂臻g環(huán)境及分子的大小和形狀等可能影響預(yù)測(cè)結(jié)果。在輸入藥物特有的信息后，QSAR模型會(huì)自動(dòng)與已有數(shù)據(jù)比較，根據(jù)結(jié)構(gòu)相似程度，判斷是否存在警示結(jié)構(gòu)。將警示結(jié)構(gòu)與QSAR模型相結(jié)合可以提高毒性預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，減少未來(lái)候選藥物產(chǎn)生不良毒性作用的可能性[17]。
2.2.3 代謝產(chǎn)物
細(xì)菌和哺乳動(dòng)物具有不同的新陳代謝能力，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比，細(xì)菌能夠有效地將硝基和偶氮化合物活化為親電代謝物。為了提高其代謝能力，在A(yíng)mes試驗(yàn)體系中常加入哺乳動(dòng)物肝 S9，但在有利于高水平氧化酶代謝的條件下，Ames試驗(yàn)結(jié)果可能為陽(yáng)性。Ames試驗(yàn)陽(yáng)性藥物相關(guān)代謝物與2年嚙齒類(lèi)動(dòng)物致癌性生物測(cè)定具有高度相關(guān)性，如Ames試驗(yàn)陽(yáng)性藥物相關(guān)代謝物低于全身總暴露量的10%，則應(yīng)考慮原料藥劑量、代謝物中活性官能團(tuán)性質(zhì)等進(jìn)行后續(xù)測(cè)試。根據(jù)ICH M3 (R2)指南，如果Ames試驗(yàn)陽(yáng)性藥物相關(guān)代謝物大于全身 總 暴 露 量 的 10% ， 則 可 能 以 處 理 藥 物 活 性 成 分 (activepharmaceutical ingredients，API)類(lèi)似的方式處理。藥物代謝物在結(jié)構(gòu)上存在致突變性，則需要特別關(guān)注。如酰胺形成的鍵對(duì)酶或酸催化的水解具有潛在的不穩(wěn)定性，從而產(chǎn)生游離的芳香胺，后者可作為雜質(zhì)或代謝物或降解物出現(xiàn)。在這種情況下，既將其作為雜質(zhì)，又要將其作為代謝物進(jìn)行Ames試驗(yàn)。
2.2.4 氧化劑
多種化學(xué)物質(zhì)可通過(guò)產(chǎn)生活性氧(reactiveoxygen species，ROS)誘導(dǎo) DNA 損傷，如農(nóng)藥、溶劑(如氯仿、四氯化碳和酚類(lèi))、兒茶酚和兒茶酚胺、雌激素、金屬和苯并[a]芘等。當(dāng)產(chǎn)生的ROS濃度超過(guò)抗氧化劑清除能力時(shí)，對(duì)細(xì)胞有害并導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等細(xì)胞大分子受損。最終，ROS的積累會(huì)引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[18]。一些藥物在A(yíng)mes試驗(yàn)中呈陽(yáng)性但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)中結(jié)果為陰性，此時(shí)需考慮是否與氧化應(yīng)激作用機(jī)制有關(guān)。Ames 菌株應(yīng)對(duì)特定氧化應(yīng)激的能力各不相同，TA97、TA100、TA102 對(duì)氧化應(yīng)激更敏感。Kirkland等[19]在不影響S9的代謝活化條件下，在A(yíng)mes試驗(yàn)系統(tǒng)中添加抗氧化劑。氧化劑乙二醛在無(wú)代謝活化條件下導(dǎo)致TA100 和 TA1535 菌株的回復(fù)菌落數(shù)大幅增加，結(jié)果均為陽(yáng)性，提示其有致突變性。經(jīng)超氧化物歧化酶預(yù)處理后，乙二醛誘導(dǎo)的TA100回復(fù)突變菌落數(shù)減少66%，TA1535減少40%。經(jīng)過(guò)氧化氫酶預(yù)處理后，TA100減少60%，TA1535減少21%。
3、體內(nèi)致突變性試驗(yàn)
體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)通常是標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合的一部分，可以提供影響化合物遺傳毒性的其他相關(guān)因素如吸收、分布、代謝和排泄等。在 Ames 試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的后續(xù)體內(nèi)研究試驗(yàn)選擇中，Zeller等[20]建議首先開(kāi)展骨髓和血液微核試驗(yàn)，并結(jié)合涵蓋其他相關(guān)組織的彗星試驗(yàn)。Kirkland 等[21]發(fā)表的一項(xiàng)關(guān)于體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)對(duì)人類(lèi)致癌物性能評(píng)估的研究表明，骨髓微核和彗星試驗(yàn)相結(jié)合，可以檢出約95%的人類(lèi)致癌物。雖然彗星和微核試驗(yàn)對(duì)可能最終導(dǎo)致基因突變的DNA損傷都很敏感，但這兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)對(duì)象為大范圍的遺傳物質(zhì)損傷，不能直接檢測(cè)基因突變。ICH S2(R1)指出，對(duì)于 Ames 試驗(yàn)陽(yáng)性藥物，后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)以評(píng)估致突變性終點(diǎn)為基礎(chǔ)，其目的是確定體外基因突變結(jié)果是否與體內(nèi)基因突變結(jié)果相關(guān)，即與體內(nèi)結(jié)果具有生物學(xué)相關(guān)性。OECD于2011年頒布的TG488指導(dǎo)原則提供了使用轉(zhuǎn)基因嚙齒動(dòng)物模型評(píng)估生殖細(xì)胞和體細(xì)胞致突變性的建議，2020 年發(fā)布相關(guān)指導(dǎo)原則，指出當(dāng) Ames 試驗(yàn)結(jié)果不明確時(shí)，體內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)可作為后續(xù)試驗(yàn)方法選擇，以下分別對(duì)這兩種方法進(jìn)行闡述。
3.1 轉(zhuǎn)基因嚙齒動(dòng)物致突變性試驗(yàn)
轉(zhuǎn)基因嚙齒動(dòng)物(transgenic rodent，TGR)致突變性試驗(yàn)作為經(jīng)典的體內(nèi)遺傳毒性評(píng)價(jià)方法至今已有20多年的歷史。該方法可利用肝、腎等不同組織對(duì)基因突變進(jìn)行檢測(cè)，突破了體內(nèi)遺傳毒性評(píng)價(jià)方法僅使用造血組織為檢測(cè)終點(diǎn)的局限。TGR主要利用 MutaTM小鼠、Big Blue®小鼠和大鼠、LacZ 質(zhì)粒小鼠和 gptdelta 小鼠和大鼠，檢測(cè)由復(fù)制過(guò)程中堿基配對(duì)或結(jié)合錯(cuò)誤或DNA序列重排引起的小規(guī)模遺傳損傷。在嚙齒動(dòng)物給藥中最高劑量應(yīng)為最大耐受劑量(maximum tolerated dose，MTD)，可以根據(jù)死亡率、體質(zhì)量減輕等標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)來(lái)確定或通過(guò)臨床觀(guān)察選擇。Luan 等[22]建立了一種對(duì)肝臟細(xì)胞色素 P450 還原酶無(wú)效的gpt delta 轉(zhuǎn)基因小鼠模型，以評(píng)估4-甲基亞硝基胺基-1-3-吡啶 基-1-丁 酮 [4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone，NNK]誘發(fā)的基因突變。試驗(yàn)顯示NNK不能在沒(méi)有P450代謝激活的情況下誘導(dǎo)肝臟突變，但可以通過(guò)肝臟P450獨(dú)立的機(jī)制誘導(dǎo)肺部突變，模型有助于確定肝臟與肝外 P450 介導(dǎo)的突變作用，以及P450與其他生物轉(zhuǎn)化酶在遺傳毒性致癌物激活中的作用。TGR 原則上可以與其他體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)相結(jié)合，與Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)相結(jié)合，有助于減少費(fèi)用和嚙齒動(dòng)物的使用，是檢測(cè)Ames陽(yáng)性結(jié)果后續(xù)工作的潛在方法。但轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成本較高，某些特定的動(dòng)物品系依賴(lài)從國(guó)外進(jìn)口，不僅價(jià)格昂貴，而且進(jìn)口周期漫長(zhǎng)且渠道單一，不具有普適性。此外，TGR檢測(cè)依賴(lài)特定報(bào)告基因的表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果可能存在偏倚。試驗(yàn)需要特殊檢測(cè)試劑，價(jià)格昂貴，技術(shù)門(mén)檻高。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測(cè)結(jié)果外推至人體還存在一定差距。
3.2 體內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)
體內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)是考察外源物質(zhì)導(dǎo)致的體內(nèi)致突變風(fēng)險(xiǎn)的最有前途的試驗(yàn)方法。該方法主要通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記和分析，隨時(shí)監(jiān)測(cè)糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol，GPI)錨相關(guān)表面蛋白的表達(dá)缺失情況，作為Pig-a基因突變的指標(biāo)。Pig-a試驗(yàn)以外周血作為檢測(cè)對(duì)象，突變細(xì)胞在外周血中出現(xiàn)的時(shí)間取決于細(xì)胞和GPI錨的周轉(zhuǎn)率，以及特定細(xì)胞類(lèi)型從骨髓到外周的運(yùn)輸時(shí)間。Nishimura 等[23]報(bào)告了在陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(paroxysmalnocturnal hemoglobinuria，PNH)患者的Pig-a基因中發(fā)現(xiàn)的一系列體細(xì)胞突變，包括堿基置換以及不同大小的插入和缺失，幾乎所有病例的PNH診斷都與Pig-a基因突變有關(guān)。Dertinger等[24]進(jìn)一步將高通量免疫磁性篩選技術(shù)引入 Pig-a 基因突變?cè)囼?yàn)，從而有效提高了細(xì)胞分析的數(shù)量與統(tǒng)計(jì)功效。OECD在2022年發(fā)布了體內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)指導(dǎo)原則TG470，給體內(nèi)基因突變的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)帶來(lái)了更多選擇。近年來(lái)，以TK6、MCL-5以及L5178Y等哺乳動(dòng)物細(xì)胞系開(kāi)展的Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)也取得了一些進(jìn)展[25]，但目前尚處于研發(fā)階段。與TGR基因突變檢測(cè)不同，Pig-a檢測(cè)不局限于特定的動(dòng)物品系，可以與重復(fù)劑量毒理學(xué)研究和其他遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)相結(jié)合，符合3R原則，同時(shí)只需采取微量外周血樣本，不會(huì)影響其他終點(diǎn)的評(píng)估。但Pig-a也具有一定局限性，它只能在紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞中進(jìn)行。因此，需證明目標(biāo)組織對(duì)藥物或其代謝物的相關(guān)暴露。IWGT工作組建議可以將Pig-a與下一代測(cè)序或深度測(cè)序相結(jié)合，從而形成可應(yīng)用于大鼠以外試驗(yàn)體系和其他造血細(xì)胞的新方法[26]。
4、下一代測(cè)序技術(shù)
在使用具有潛在遺傳毒性的藥物治療后，細(xì)胞基因突變頻率對(duì)于危害評(píng)估十分關(guān)鍵。已經(jīng)建立的體外體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型不能提供整個(gè)基因組序列完整性信息。下一代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)技術(shù)提供了多種研究基因組的方法，包括整個(gè)基因組、外顯子組和轉(zhuǎn)錄子組的測(cè)序。NGS技術(shù)不依賴(lài)任何特定的基因或細(xì)胞系，具有高通量和大規(guī)模并行測(cè)序的能力，可以同時(shí)篩選多個(gè)樣本中的各種基因組變化。盡管NSG明顯優(yōu)于傳統(tǒng)Sanger測(cè)序，但在DNA制備、擴(kuò)增和測(cè)序過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)低水平測(cè)序錯(cuò)誤和偽影，可導(dǎo)致高達(dá)1%的人工突變頻率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織的正常每個(gè)核苷酸突變頻率(<1×10-7)，且在某些序列背景下，可能會(huì)更高。因此，為了檢測(cè)更低頻率的突變并提高測(cè)序準(zhǔn)確度，需要開(kāi)發(fā)更靈敏的NGS技術(shù)。
目前認(rèn)為降低低頻測(cè)序錯(cuò)誤率最有效的策略是分子一致性測(cè)序，基于單鏈或互補(bǔ)鏈對(duì)同一模板來(lái)源的多個(gè)拷貝進(jìn)行錯(cuò)誤校正。Schmitt 等[27]通過(guò)對(duì) DNA 互補(bǔ)鏈添加分子標(biāo)記，開(kāi)發(fā)了Duplex Sequencing方法，測(cè)序錯(cuò)率低至1×10-7，但測(cè)序深度和成本高，所需拷貝數(shù)多，不適用于大型基因組。Hoang等[28]在Duplex Sequencing基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)BotSeq，對(duì)PCR擴(kuò)增后的文庫(kù)進(jìn)行稀釋達(dá)到提高測(cè)序效率的目的，可用于全基因組測(cè)序。Abascal等[29]又在BotSeq基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了NanoSeq，引入特定限制性?xún)?nèi)切酶和ddBTPs，降低文庫(kù)制備損傷和末端修復(fù)錯(cuò)誤，測(cè)序效率高，錯(cuò)誤率降低至 1×10-8。為了避免 PCR 擴(kuò)增引入的偽影，2020年，You等[30]開(kāi)發(fā)了一種無(wú)PCR的縮短雙鏈獨(dú)立一致性的測(cè)序方法 PECC-Seq(paired-end complementary consensussequencing)，以剪切點(diǎn)為內(nèi)源標(biāo)記，進(jìn)一步簡(jiǎn)化文庫(kù)制備及后續(xù)生物信息學(xué)分析，理論錯(cuò)誤率可降低至1×10-9。在全基因組范圍內(nèi)的低頻測(cè)序表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確度和較好的成本效益，在臨床液體活檢、癌癥研究等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。應(yīng)進(jìn)一步對(duì)新的低頻測(cè)序方法進(jìn)行研究，以繼續(xù)擴(kuò)大測(cè)序應(yīng)用范圍。
5、小 結(jié)
化合物的Ames試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，首先應(yīng)分析陽(yáng)性結(jié)果產(chǎn)生的原因。鑒于遺傳毒性試驗(yàn)方法基于特定檢測(cè)終點(diǎn)而形成的特點(diǎn)，應(yīng)充分考慮Ames試驗(yàn)結(jié)果是否與細(xì)菌試驗(yàn)體系的特殊性或受試物的特殊作用機(jī)制有關(guān)，是否與細(xì)菌特定的代謝活化體系有關(guān)，是否與存在特定的警示結(jié)構(gòu)有關(guān)。建議使用相關(guān)結(jié)構(gòu)化合物或在調(diào)整試驗(yàn)條件后開(kāi)展比較研究，以判斷是否可排除其人體致癌性風(fēng)險(xiǎn)。后續(xù)可選擇以基因突變?yōu)闄z測(cè)終點(diǎn)的評(píng)價(jià)方法包括，小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)、體內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)和TGR 致突變性試驗(yàn)等(表1)。當(dāng)前下一代測(cè)序技術(shù)國(guó)際上正在研發(fā)階段。除上述以致突變性為檢測(cè)終點(diǎn)的試驗(yàn)方法外，也可考慮開(kāi)展轉(zhuǎn)基因小鼠6個(gè)月致癌性試驗(yàn)，從而在有限的時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本內(nèi)獲得TD50數(shù)據(jù)用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。此外，也可開(kāi)展多劑量的體內(nèi)致突變性/致癌性試驗(yàn)，驗(yàn)證其是否具有作用閾值。開(kāi)展體內(nèi)研究時(shí)可伴隨開(kāi)展藥代/毒代動(dòng)力學(xué)、組織加合物檢測(cè)、突變譜檢測(cè)等機(jī)制研究，從而進(jìn)一步了解其致突變性作用特點(diǎn)，為同類(lèi)藥物的設(shè)計(jì)與合成提供重要參考。
▲表1-致突變性檢測(cè)方法比較
綜上所述，遺傳毒性試驗(yàn)是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要組成部分，主要用于藥物早期致癌性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。本文回顧了致突變性與致癌性風(fēng)險(xiǎn)間的關(guān)聯(lián)，以及Ames試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的原因及當(dāng)前國(guó)際上對(duì)Ames試驗(yàn)為陽(yáng)性結(jié)果的藥物監(jiān)管要求，總結(jié)了可供選擇的后續(xù)體內(nèi)試驗(yàn)方法，并提出當(dāng)藥物在非臨床安全性評(píng)價(jià)中Ames試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)的評(píng)價(jià)思路和機(jī)制研究策略，為藥物研發(fā)及評(píng)價(jià)提供借鑒。
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