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這一期我們分享原代培養(yǎng)的入門知識(shí)，其中不會(huì)涉及具體的操作步驟，而是向剛?cè)腴T的同學(xué)科普這個(gè)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。

 

包括以下內(nèi)容：

 

原代培養(yǎng)的概念和流程

分離組織的操作和注意事項(xiàng)

解離組織獲取細(xì)胞的三種常見方法

 

原代培養(yǎng)是指細(xì)胞分離之后至第一次傳代之前的細(xì)胞培養(yǎng)階段，之后細(xì)胞就轉(zhuǎn)變成細(xì)胞系。

 

原代培養(yǎng)可分為 4 個(gè)步驟:

獲取樣品

分離組織

解剖或解離組織

接種于培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)

用于原代培養(yǎng)的樣品可來(lái)源于2類，一是實(shí)驗(yàn)室樣本，包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的器官、組織，例如胚胎、腸道等；二是臨床樣本，例如通過(guò)手術(shù)過(guò)程分離出來(lái)的病人組織。

 

分離組織

分離組織的時(shí)候，要注意無(wú)菌操作，在無(wú)菌環(huán)境下切除組織，并將其至于PBS緩沖液或運(yùn)輸專用的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移至下一步操作的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。

另外，分離組織時(shí)有2個(gè)小技巧：

在取材時(shí)可以盡量多去除脂肪和壞死的組織。

使用鋒利的手術(shù)刀將組織切碎，以減小對(duì)組織的損傷

 

獲取細(xì)胞

獲取組織之后，我們要把細(xì)胞從組織中分離出來(lái)繼續(xù)生長(zhǎng)，這個(gè)操作可分為兩種:

將組織塊貼附于適宜的基質(zhì)中，細(xì)胞可從組織塊向外遷移生長(zhǎng)，這個(gè)操作過(guò)程叫原代外植;

將組織塊用機(jī)械法或酶消化法處理獲得細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞懸液，其中部分細(xì)胞最終將黏附于基質(zhì)開始生長(zhǎng)。

如果所取組織很小，則適于用原代外植法；如果組織較大，可用酶消化法以獲得更多的細(xì)胞。

軟的組織適合于用機(jī)械法解離，一些硬的組織，如果產(chǎn)物的多少并不重要，或者從纖維間質(zhì)組織分離松散黏附的細(xì)胞，也可用機(jī)械法分離。

下圖是不同處理方法的路線圖，同學(xué)們可以用于參考。

相對(duì)于原代外植，酶處理或機(jī)械法分離出細(xì)胞可以有效避免細(xì)胞因遷移率不同而選擇性生長(zhǎng)的問題。

同時(shí)，酶解法可以在比較短的時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)出大量的細(xì)胞，因此，在實(shí)驗(yàn)室中較常見，我們選擇這兩種方法來(lái)詳細(xì)講解。

 

胰蛋白酶處理

酶處理方法主要分為胰蛋白酶和膠原酶處理，而胰蛋白酶的反應(yīng)條件來(lái)劃分又可以分為冷胰蛋白酶和溫胰蛋白酶兩種。

溫胰蛋白酶消化技術(shù)適于在相對(duì)短的時(shí)間消化大的組織，尤其對(duì)于整個(gè)小鼠胚胎或雞胚。

由于成年組織含有大量纖維結(jié)締組織，故對(duì)成年組織效果不好，機(jī)械攪拌可損傷較敏感的細(xì)胞，如上皮細(xì)胞。

用胰蛋白酶消化組織的缺點(diǎn)之一是于 37度條件下長(zhǎng)期作用可損傷細(xì)胞，因此采用溫胰蛋白酶消化法，每隔30min收集一次細(xì)胞，而不是將組織一直浸泡在胰蛋白酶中(3~4h)等待其完全消化。

與溫消化相比,冷消化可獲得較高的細(xì)胞存活率,培養(yǎng)24h 后生存率也提高。同時(shí)可保留更多的細(xì)胞種類。

例如，經(jīng)冷消化處理的小鼠胚胎培養(yǎng)物含有更多的上皮細(xì)胞。冷消化也很方便，因?yàn)椴挥脭嚢韬碗x心，在4度條件下過(guò)夜即可。然而，這種方法受限于一次可處理的組織量。

 

膠原酶處理

如果組織含有大量纖維成分，又對(duì)胰蛋白酶非常敏感而不能使用胰蛋白酶消化的話。常用的是用膠原酶來(lái)消化處理。例如人的腫瘤組織、小鼠腎臟。

使用膠原酶消化的過(guò)程比較慢但比較緩和，無(wú)需機(jī)械振蕩和特殊設(shè)備。對(duì)于大于1g 的組織，由于消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，費(fèi)用也會(huì)非常高，因?yàn)樾枰罅康哪z原酶。

膠原酶可解離大多數(shù)結(jié)締組織，但存在成纖維細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)的問題，故需要再進(jìn)行選擇性培養(yǎng)或進(jìn)行細(xì)胞分離。

 

機(jī)械法處理

最后，就是機(jī)械法解離細(xì)胞。有幾種操作可以通過(guò)機(jī)械解離收集到細(xì)胞：

切碎或“溢出”，切割作用或被切表面的破損使細(xì)胞釋放出來(lái)

篩網(wǎng)擠壓，用注射器芯將組織擠壓過(guò)篩網(wǎng)

注射器吸打，將組織吸入注射器中，通過(guò)-個(gè)大孔徑的針頭或?qū)Ч軐⒁后w快速打出

用吸管打碎，用大孔徑的吸管吸取組織塊上下吹打

 

適用于機(jī)械解離的樣本僅僅是較軟的組織，如脾、胚肝、胚腦、成年腦或部分人和動(dòng)物的軟質(zhì)腫瘤。

對(duì)于腦，即使易于做到完全分解，然而與酶消化的結(jié)果相比，雖然花費(fèi)的時(shí)間較少，但懸液中存活的細(xì)胞數(shù)也少。

若組織取材不受限，細(xì)胞數(shù)量無(wú)關(guān)緊要，在短時(shí)間內(nèi)機(jī)械法可產(chǎn)生與酶消化同樣多的活細(xì)胞，但這種方法要消耗更多的組織，同時(shí)，死細(xì)胞可通過(guò)離心而去除。

 

總結(jié)

分離組織并進(jìn)行原代培養(yǎng)，是特殊功能細(xì)胞培養(yǎng)的第一個(gè)也是最重要的階段。

若在這一階段細(xì)胞丟失了，則是不可補(bǔ)救的。因此，我有2個(gè)建議給大家：

1 原代細(xì)胞存活率較低，因此接種密度可以比常規(guī)的細(xì)胞系要更高，營(yíng)養(yǎng)條件也可以適當(dāng)提高，例如采用胎牛血清而不是小牛血清進(jìn)行培養(yǎng)。

2 不同種類的細(xì)胞應(yīng)采用相應(yīng)的解離方法，例如，胰蛋白酶比膠原酶作用強(qiáng)，建立單細(xì)胞懸液更高效；膠原酶不能解離上皮細(xì)胞，但這一特性成為它的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，可利用它使上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞分離并保持上皮細(xì)胞團(tuán)的活力。機(jī)械法比酶消化法快，但對(duì)細(xì)胞損傷大。