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GPX4（谷胱甘肽過氧化物酶4）是一種非常重要的抗氧化酶。GPX4主要通過催化GSH（谷胱甘肽）還原各種過氧化物（如過氧化氫H?O?、脂質(zhì)過氧化物），將其轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇和水，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。

GPX4在細(xì)胞的抗氧化防御、疾病發(fā)生發(fā)展以及治療策略等多個(gè)方面都發(fā)揮著重要作用，是目前研究的熱點(diǎn)之一。特別是在鐵死亡研究方面，GPX4是重要的檢測(cè)指標(biāo)之一。

因此，通常地GPX4酶活性測(cè)定具體步驟如下：

一、實(shí)驗(yàn)步驟

1.樣本制備

（1）原理：首先需要從細(xì)胞或組織中提取蛋白質(zhì)，以便后續(xù)測(cè)定GPX4酶的活性。GPX4是一種含硒的蛋白質(zhì)，其活性依賴于細(xì)胞內(nèi)的生理環(huán)境和合適的緩沖條件。

（2）操作步驟：

1）細(xì)胞樣本：

將狀態(tài)良好的細(xì)胞鋪至孔板中，特定實(shí)驗(yàn)處理后用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，800~1500rpm離心5min，棄上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2~3次，以去除培養(yǎng)基等雜質(zhì)。

加入適量的細(xì)胞裂解液如含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑RIPA裂解液，防止蛋白質(zhì)降解和磷酸化狀態(tài)改變，冰上裂解30min左右，期間可輕輕振蕩或渦旋，使細(xì)胞充分裂解。

裂解后，4℃，12000rpm離心15min，取上清即為蛋白提取液，可使用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量。

2）組織樣本：

取新鮮組織，迅速放入液氮（-196℃）中冷凍，然后在研缽中研磨成粉末狀，可加入液氮防止組織解凍。

加入適量的組織裂解液（如上述RIPA裂解液），在冰上繼續(xù)裂解30~60min，期間不時(shí)攪拌。

4℃，12000rpm離心15min，取上清，使用BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度。

2.反應(yīng)體系設(shè)置

（1）原理：GPX4可以催化谷胱甘肽（GSH）與過氧化氫（H?O?）的反應(yīng)，生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）和水。通過檢測(cè)GSH的減少或GSSG的生成量，可以間接反映GPX4的活性。反應(yīng)體系中還會(huì)加入一些輔助試劑，以保證反應(yīng)的順利進(jìn)行。

（2）操作步驟：一般在96孔板或微量離心管中進(jìn)行反應(yīng)，以下是一個(gè)典型的反應(yīng)體系（示例，可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整）：

加入適量的蛋白樣品（根據(jù)BCA定量結(jié)果調(diào)整，使反應(yīng)體系中總蛋白量在一定范圍內(nèi)，如10~50μg）。

加入反應(yīng)緩沖液，如50mM Tris-HCl（pH7.5）、1 mM EDTA、5 mM NaN?等，為GPX4提供合適的反應(yīng)環(huán)境。加入谷胱甘肽還原酶（GR）和NADPH，GR可將GSSG還原為GSH，NADPH為其提供還原力，保證GSH的循環(huán)利用，維持反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行。

加入一定量的GSH和H?O?，啟動(dòng)反應(yīng)。對(duì)于微量離心管，反應(yīng)總體積一般為100~200μL；對(duì)于96孔板，每孔體積可根據(jù)板的規(guī)格調(diào)整，如200μL或100μL。

3.反應(yīng)檢測(cè)

（1）原理：可以通過檢測(cè)NADPH的消耗來反映GPX4的活性，因?yàn)樵诜磻?yīng)過程中，NADPH被氧化為NADP?，其在340nm處的吸光度會(huì)下降。

（2）操作步驟：

將反應(yīng)體系置于37℃的恒溫箱或酶標(biāo)儀中，利用酶標(biāo)儀的動(dòng)力學(xué)模式，在340nm處連續(xù)監(jiān)測(cè)吸光度的變化

記錄初始吸光度值（A?）和一定時(shí)間內(nèi)（如5~10min）的吸光度變化（ΔA）。

4.酶活性計(jì)算

（1）原理：根據(jù)吸光度的變化，利用朗伯-比爾定律（A=εbc，其中A為吸光度，ε為摩爾吸光系數(shù)，b為光程，c為物質(zhì)的量濃度）計(jì)算GPX4的活性。

（2）操作步驟：

首先根據(jù)NADPH的摩爾吸光系數(shù)（ε=6.22×10³M?¹cm?¹）和光程（b，一般為1cm或根據(jù)實(shí)際使用的比色皿或酶標(biāo)儀確定）計(jì)算NADPH的消耗速率（Δc/Δt）。

酶活性單位通常定義為每min催化1 μmol NADPH氧化所需的酶量，根據(jù)反應(yīng)體系中蛋白的量和時(shí)間，計(jì)算GPX4的酶活性，公式如下：酶活性（U/mg蛋白）=[（ΔA×V）/（ε×b×t×m）]×稀釋倍數(shù)。其中V為反應(yīng)體系體積，t為反應(yīng)時(shí)間（min），m為反應(yīng)體系中蛋白的質(zhì)量（mg）。 

二、注意事項(xiàng)

1.樣本處理：樣本在提取過程中要盡量保持低溫，防止蛋白質(zhì)變性和酶活性喪失。裂解液中加入的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑要保證有效，避免GPX4被降解或其磷酸化狀態(tài)被改變，影響酶活性。

2.反應(yīng)體系：反應(yīng)緩沖液的pH值要準(zhǔn)確，因?yàn)镚PX4對(duì)pH敏感，一般最適pH在7.0~8.0之間。加入的各種試劑要新鮮配制或保存在合適的條件下，如NADPH易氧化，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配或在-20℃保存，使用時(shí)避免反復(fù)凍融。

3.酶標(biāo)儀設(shè)置：確保酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置準(zhǔn)確，在340nm處檢測(cè)吸光度。對(duì)于動(dòng)力學(xué)模式，設(shè)置合適的測(cè)量時(shí)間間隔和總時(shí)長(zhǎng)，以準(zhǔn)確記錄吸光度的變化。

4.對(duì)照設(shè)置：要設(shè)置空白對(duì)照，使用不含蛋白樣品的反應(yīng)體系，排除試劑本身的干擾?？稍O(shè)置陽性對(duì)照，使用已知活性的GPX4標(biāo)準(zhǔn)品或已知GPX4活性的樣本，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系的可靠性。

5.數(shù)據(jù)分析：進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。若結(jié)果異常，可檢查樣本提取、反應(yīng)體系、酶標(biāo)儀操作等環(huán)節(jié)是否出現(xiàn)問題，通過逐步排查找到問題所在。