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一、單細(xì)胞測(cè)序的概念及特點(diǎn)

 

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是指在單個(gè)細(xì)胞的水平上，對(duì)基因組、轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)信息進(jìn)行高通量測(cè)序分析的一種技術(shù)。但是，單細(xì)胞測(cè)序的總量并不僅僅是幾個(gè)細(xì)胞那么簡(jiǎn)單，根據(jù)樣本類型和測(cè)序需求，可以在單細(xì)胞水平下對(duì)成千上萬的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序。既然總量這么大，為什么還要進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞分辨率的測(cè)序呢？為什么不一次性把組織內(nèi)的所有細(xì)胞都檢測(cè)完然后進(jìn)行分析呢？

 

這是因?yàn)楸M管多細(xì)胞生物是由一個(gè)細(xì)胞不斷增殖分化而來的，但隨著這一過程的深入，細(xì)胞與細(xì)胞之間會(huì)產(chǎn)生異質(zhì)性，甚至我們已經(jīng)認(rèn)定的同一類型細(xì)胞當(dāng)中，也會(huì)有或大或小的差異，這些差異決定了細(xì)胞真正的類型和功能。

 

傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)是在組織水平（至少是在多細(xì)胞水平）上進(jìn)行的，得到的數(shù)據(jù)也是這些細(xì)胞的平均值，因此沒法得知細(xì)胞的異質(zhì)性。而單細(xì)胞測(cè)序可以能夠揭示每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)狀態(tài)，從而得到異質(zhì)性信息。

 

 

 （圖片來源：10x Genomics）

 

二、單細(xì)胞檢測(cè)策略

 

目前，單細(xì)胞的檢測(cè)主要有兩種策略：

 

1.通過流式細(xì)胞術(shù)（主要用于細(xì)胞樣品）或者激光顯微切割（LCM）技術(shù)（主要用于組織切片）分離單個(gè)細(xì)胞，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，最后進(jìn)行測(cè)序。

 

這種方法通量低，且隨著待測(cè)細(xì)胞數(shù)目的增多，測(cè)序成本也會(huì)大幅提升。但臨床上的樣本細(xì)胞數(shù)量動(dòng)輒10^9個(gè)以上，想要以幾十個(gè)細(xì)胞的信息代表臨床樣本，顯然是不合適的。

 

2.基于barcode測(cè)序。將單細(xì)胞懸液和帶有barcode的珠子包裹在一個(gè)油滴之中，并對(duì)其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，這樣每個(gè)單細(xì)胞的cDNA文庫(kù)就帶上了特異性的barcode。最后將所有單細(xì)胞的cDNA文庫(kù)混在一起測(cè)序，同時(shí)通過程序識(shí)別barcode，區(qū)分出單細(xì)胞。

 

這種方法可以通過一次建庫(kù)，測(cè)到成百上千個(gè)細(xì)胞的信息。

 

（Single‐cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview, Clinical and translational medicine 10.1002/ctm2.694）

 

三、單細(xì)胞的分離制備（以腫瘤組織為例）

 

1.制備單細(xì)胞懸液：

 

（1）一般采用脫頸處死，解剖過程務(wù)必快速準(zhǔn)確，盡量保留細(xì)胞的活性；

 

（2）使用預(yù)冷過的能夠維持細(xì)胞活性的液體（如生理鹽水/PBS/RPMI-1640等）沖洗組織；

 

（3）剪碎組織：根據(jù)后續(xù)測(cè)序的需要（優(yōu)先保證細(xì)胞數(shù)量還是質(zhì)量）選擇合適體積的組織進(jìn)行切碎，過程中注意預(yù)冷；

 

（4）常規(guī)消化離心：這一步在處理不同組織、不同細(xì)胞時(shí)的注意事項(xiàng)較多，建議多查閱文獻(xiàn)；

 

（5）紅細(xì)胞裂解：像心臟、肝臟、脾臟等紅細(xì)胞含量豐富的組織難免需要裂解紅細(xì)胞。根據(jù)上面切碎的組織大小加入裂紅液裂紅，結(jié)束后用PBS終止。如果裂解不干凈，可以重復(fù)一次，但不能超過兩次。離心重懸后即可獲得單細(xì)胞懸液。

 

2.樣本細(xì)胞篩選：

 

單細(xì)胞篩選的方法包括：激光捕獲顯微分離（laser capture microdissection,LCM）、顯微微管操作法（Micropipetting）、流式細(xì)胞分選（fluorescence activated cell sorting,FACS）、有限稀釋法（Limiting dilution）、微流控技術(shù)（microfluidics）等。方法各有優(yōu)劣，可根據(jù)需要靈活選擇。

 

（1）有限稀釋法

 

有限稀釋法是一種通過連續(xù)稀釋細(xì)胞群來獲得單細(xì)跑的方法，此方法操作簡(jiǎn)便,且不需要特殊的設(shè)備,但是依賴于梯度稀釋計(jì)算,不是直觀的單個(gè)細(xì)胞分離,容易出現(xiàn)錯(cuò)誤。這種方法可以說是最簡(jiǎn)單、也是最不準(zhǔn)確的單細(xì)胞分離的方法，很少用于復(fù)雜樣品的單細(xì)胞分離。

 

（2）顯微微管操作法

 

當(dāng)細(xì)胞樣品的復(fù)雜度較低時(shí)，可以采用顯微操作技術(shù)根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)待征來分選細(xì)跑。目前主要用于分離一些難以培并的微生物細(xì)跑，但是由于其通量低、人力成本高、容易造成細(xì)胞的機(jī)械損傷等缺點(diǎn)，難以廣泛應(yīng)用。

 

（3）激光捕獲顯微分離

 

當(dāng)目的細(xì)胞在細(xì)跑群中呈分散分布，旦占有的比例很小時(shí)，一般采用激光捕獲顯微分離(LCM) 技術(shù)，直接從組織中分離單細(xì)跑。這種技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中應(yīng)用比較廣泛。但由于操作過程中切割精度有限，容易摻雜相鄰細(xì)跑的原生質(zhì)，以及目的細(xì)胞容易丟失核染色體片段。因此在轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中，一般不采用這種技術(shù)。

 

（4）微流控技術(shù)

 

與其他方法比較, 微流控平臺(tái)相結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在降低單細(xì)胞測(cè)序的噪聲以及基因組擴(kuò)展更加均勻方面具有優(yōu)勢(shì), 顯示出了良好的應(yīng)用前景。在物理學(xué)上，流體慣性可以在微米級(jí)尺度上忽略，微流控技術(shù)正是利用這一原理，人為控制（細(xì)胞）流體的流動(dòng)，來實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的分離。但是盡管微流控芯片技術(shù)因樣品用量小而可以有效避免污染，但是由于其成本較高，故實(shí)際應(yīng)用并不廣泛。

 

（5）流式細(xì)胞分選

 

流式細(xì)胞分選技術(shù)是目前最流行的單細(xì)胞分離技術(shù)。流式系統(tǒng)按照細(xì)胞特征 (大小、顏色、核酸、生物化學(xué)活性等) 迅速將單個(gè)細(xì)胞分選到幾百個(gè)孔板中。但是, 這種方法也有固有的缺陷: 一是需要大量的細(xì)胞懸浮液, 會(huì)降低低豐度細(xì)胞的獲得率;二是分選速率比較快, 容易造成細(xì)胞損傷。

 

（Technologies for Single-Cell Isolation. International journal of molecular sciences, 10.3390/ijms160816897）

 

四、遺傳物質(zhì)的提取擴(kuò)增

 

單細(xì)胞測(cè)序起始樣本中核酸含量極低，典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含大約10 pg總RNA, 其中mRNA僅有大約0.1~0.5 pg, 而目前深度測(cè)序技術(shù)需要納克級(jí)別的DNA, 因此文庫(kù)構(gòu)建過程需要將起始的核酸擴(kuò)增數(shù)十萬倍。

 

目前主要的單細(xì)胞測(cè)序擴(kuò)增方法有：?jiǎn)渭?xì)胞全基因組擴(kuò)增和單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增。

 

全基因組擴(kuò)增(WGA)是將從單細(xì)胞中提取出的DNA進(jìn)行擴(kuò)增以獲取大量DNA樣品的技術(shù)。如今已研發(fā)出多種擴(kuò)增方法,例如基于 PCR法的簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR）、基于等溫?cái)U(kuò)增法的多重置換擴(kuò)增（MDA）、基于PCR法和等溫?cái)U(kuò)增法的多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（MALBAC）。

 

利用PCR技術(shù)進(jìn)行全基因組的擴(kuò)增，擴(kuò)增的覆蓋度比較高，但容易出現(xiàn)錯(cuò)誤和覆蓋度不均的現(xiàn)象，因此該技術(shù)目前已經(jīng)在逐步淘汰。

 

多重置換擴(kuò)增技術(shù)能在常溫下擴(kuò)增,避免了高溫下DNA降解對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量的影響及GC含量不同引發(fā)的優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增。但是此方法的擴(kuò)增均勻性不高。多重置換擴(kuò)增技術(shù)可用于單核苷酸多態(tài)性以及突變相關(guān)的研究。

 

多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)是目前最先進(jìn)的全基因組擴(kuò)增技術(shù)，基因組覆蓋率和擴(kuò)增的均勻性都顯著高于其他技術(shù)，因此常用于那些樣本稀少、用常規(guī)方法無法進(jìn)行基因組或轉(zhuǎn)錄組分析，或者樣本高度異質(zhì)，細(xì)胞之間存在重要差異的樣本。

單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增（Whole transcriptome amplification, WTA）方法需要將單細(xì)胞內(nèi)的mRNA提取后，通過反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。一般常采用PCR指數(shù)擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄線性擴(kuò)增和Phi29聚合酶擴(kuò)增三種方法。

 

五、高通量測(cè)序

 

下面這張圖是單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析內(nèi)容的概述。該圖顯示了單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)實(shí)際分析中的分析內(nèi)容的總結(jié)，其可以分為四個(gè)分析模塊，分別是(A)數(shù)據(jù)預(yù)處理模塊，(B)通用分析模塊，(C)探索性分析模塊和(D)可選分析模塊。

 

 

 

對(duì)單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的分析是另一個(gè)重要部分，到了這一部分就進(jìn)入了生物信息學(xué)的研究領(lǐng)域。一般多花一些錢測(cè)序公司會(huì)負(fù)責(zé)產(chǎn)出配套的數(shù)據(jù)分析，根據(jù)難度不同價(jià)格也不同。比如你根據(jù)前期文獻(xiàn)調(diào)研，已經(jīng)確定了自己想要的數(shù)據(jù)分析圖片類型和圖片數(shù)量，那么價(jià)格會(huì)相對(duì)低一些。但如果你沒有明確的分析方向，需要讓測(cè)序公司的數(shù)據(jù)分析人員同步跟進(jìn)你的課題進(jìn)展，價(jià)格自然會(huì)變高。

 

另外一種選擇，自學(xué)數(shù)據(jù)分析。目前網(wǎng)上有著非常多數(shù)據(jù)分析的教學(xué)視頻和配套代碼，并且也有越來越多的公共單細(xì)胞數(shù)據(jù)可以獲取，對(duì)于非常多缺少經(jīng)費(fèi)的課題組而言，無疑提供了非常好的數(shù)據(jù)資源。在上游的數(shù)據(jù)預(yù)處理和初步統(tǒng)計(jì)分析方面，推薦推薦大家去學(xué)習(xí)python，在后續(xù)部分，R語(yǔ)言是進(jìn)行組學(xué)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析及可視化最推薦學(xué)習(xí)的工具。對(duì)于醫(yī)學(xué)背景或者生物學(xué)背景的同學(xué)而言，數(shù)據(jù)分析和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)/臨床實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的干濕結(jié)合方法是發(fā)文的主流，因此我們并不需要在數(shù)據(jù)分析領(lǐng)域作根本性的創(chuàng)新，只需要正確的理解和運(yùn)用即可。因此只要跟著正確的方法，就可以快速掌握。