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氣相色譜方法開發(fā)與驗證

嘉峪檢測網(wǎng) 2025-02-25 11:52

氣相色譜（GC）作為一種高效、靈敏的分離分析技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、食品安全、藥物分析等領(lǐng)域。要建立可靠的氣相色譜分析方法，需要進行系統(tǒng)化的步驟設(shè)計和嚴格的驗證過程。今天，將與大家探討氣相色譜方法的建立與驗證流程。

1.氣相色譜方法開發(fā)流程

方法開發(fā)就是針對一個或一批樣品建立一套完整的分析方法。就氣相色譜而言，首先確定樣品預(yù)處理方法；然后優(yōu)化分離條件，直至達到滿意的分離結(jié)果；最后建立數(shù)據(jù)處理方法包括定性鑒定和定量測定。當然，這一方法要真正成為實用方法，還必須進行驗證。

圖1.GC方法開發(fā)一般步驟

氣相色譜方法的開發(fā)步驟包括樣品的預(yù)處理、儀器配置的選擇、初始操作條件的設(shè)定、分離條件的優(yōu)化以及定性和定量分析的方法等，詳細如下。

1.樣品的來源與預(yù)處理方法

（1）樣品的類型

氣相色譜能直接分析的樣品必須是氣體或液體，固體樣品必須溶解在適當?shù)娜軇┲?，而且還要保證樣品中不含氣相色譜不能分析的組分（如無機鹽）或可能損害色譜柱的組分。在接到未知樣品時，需先了解其來源，從而推測樣品中可能含有的組分及沸點范圍。如果樣品可以直接分析，只需找到合適的溶劑，如丙酮、己烷、氯仿、苯等GC常用溶劑。一般而言，溶劑應(yīng)具有較低的沸點，便于與樣品分離。盡量避免使用水、二氯甲烷、甲醇等溶劑，因為這些溶劑可能縮短色譜柱的使用壽命。此外，若使用毛細管柱，樣品濃度不宜過高，以免色譜柱超載。

（2）樣品的前處理

如果樣品中有不能用氣相色譜分析的組分，或者樣品濃度太低、濃度太高等，這就要進行必要的預(yù)處理，如各種萃取、濃縮、稀釋、提純等方法。

（3）樣品濃度

為了避免超載，我們應(yīng)保持樣品濃度在1000ppm以下。

無論是預(yù)處理還是氣相色譜分析條件，文獻查找都是重要的方法開發(fā)步驟。在開始實驗之前，應(yīng)該先查文獻。若文獻中已有相同樣品的分析方法，可在此基礎(chǔ)上優(yōu)化實驗條件，從而加快方法開發(fā)的進程。即使只能找到類似樣品的分析方法，也可作為重要參考，避免走不必要的彎路。

2.儀器配置的選擇

儀器配置就是用于分析樣品的方法采用什么進樣裝置、什么載氣、什么色譜柱以及什么檢測器。比如，要用GC分析菊花的揮發(fā)性成分，就需要一個頂空進樣器；要測定蔬菜中痕量含氯農(nóng)藥的殘留量，就要用電子捕獲檢測器。就色譜柱而言，常用的固定相有非極性的OV-1（SE-30）、弱極性的SE-54、極性的OV-17和PEG-20M等?？筛鶕?jù)極性相似相溶原理來選用，即分離一般脂肪烴類（如柴油或汽油）時多用OV-1（SE-30），分析醇類和酯類（如含酒精飲料）多用PEG-20M，分析農(nóng)藥殘留量則多用OV-17或OV-1701。而要分析特殊的樣品，如手性異構(gòu)體就需要用到手型柱。對于很復(fù)雜的混合物，SE-54往往是首選的固定相。

3.初始操作條件設(shè)定

當樣品準備好，且儀器配置確定之后，就可開始進行嘗試性分離。這時要確定初始分離條件，主要包括進樣量、進樣口溫度、色譜柱溫度、檢測器溫度和載氣流速等。

（1）進樣量

要根據(jù)樣品濃度、色譜柱容量和檢測器靈敏度來確定。樣品濃度不超過10mg/ml時填充柱的進樣量通常為1~5μL，而對于毛細管柱，若分流比為50:1時，進樣量一般不超過2μL。如果這樣的進樣量不能滿足檢測器的靈敏度要求時，可考慮加大進樣量，但以不超載為限。必要時先對樣品進行預(yù)濃縮，還可考慮采用專門的進樣技術(shù)，如大體積進樣，還可采用靈敏度更高的檢測器。

（2）進樣口溫度

主要由樣品的沸點范圍決定，還要考慮色譜柱的使用溫度，既要保證樣品全部汽化，還要保證汽化的樣品組分能夠全部流出色譜柱，而不會在柱中冷凝。原則上講，進樣口溫度高一些有利，一般要接近樣品中沸點最高的組分的沸點，但要低于易分解組分的分解溫度，常用的條件是250~350℃。大多數(shù)先進氣相色譜分析儀的進樣口溫度均可達到450℃，這時，沸點為500℃左右的組分均可汽化（因為混合物在溶液狀態(tài)下，組分的沸點會降低一些，而且樣品的汽化是在流動的載氣中進行的）。實際操作中，進樣口溫度可在一定范圍內(nèi)設(shè)定，只要保證樣品完全汽化即可，而不必進行很精確的優(yōu)化。注意，當樣品中某些組分會在高溫下分解時，就要適當降低汽化溫度。必要時可采用冷柱頭上進樣或程序升溫汽化（PTV）進樣技術(shù)。

（3）色譜柱溫度

主要由樣品的復(fù)雜程度和汽化溫度決定。原則是既要保證待測物的完全分離，又要保證所有組分流出色譜柱，且分析時間越短越好。組成簡單的樣品最好用恒溫分析，這樣分析周期會短一些。特別是采用填充柱時，恒溫分析時色譜圖的基線要比程序升溫穩(wěn)定得多。對于組成復(fù)雜的樣品，常需要用程序升溫分離，因為在恒溫條件下，如果柱溫較低，則低沸點分離得好，而高沸點組分的流出時間會太久，造成峰展寬，甚至滯留在色譜柱中造成污染；反之，當柱溫太高時，低沸點組分又難以分離。毛細管柱的一個最大優(yōu)點就是可在較寬的溫度范圍內(nèi)操作，這樣既保證了待測組分的良好分離，又能實現(xiàn)盡可能短的分析時間。

色譜柱的初始溫度應(yīng)接近樣品中最輕組分的沸點，而最終溫度則取決于最重組分的沸點。升溫速率則要依樣品的復(fù)雜程度而定。

（4）檢測器的溫度

是指檢測器加熱溫度，而不是實際檢測點，如火焰的溫度。檢測器溫度的設(shè)置原則是保證流出色譜柱的組分不會冷凝，同時滿足檢測器靈敏度的要求。大部分檢測器的靈敏度受溫度影響不大，故檢測器溫度可參照色譜柱的最高溫度設(shè)定，而不必精確優(yōu)化。

（5）載氣流速的確定

開始可按照比最佳流速（以填充柱為例：氮氣約為20cm/s，氦氣約為25cm/s，氫氣約為30cm/s）高10%來設(shè)定，然后再根據(jù)分離情況進行調(diào)節(jié)。原則是既保證待測物的完全分離，又要保證盡可能短的分析時間。用填充柱時，載氣流速一般設(shè)為30cm/s。

此外，當所有檢測器需要燃燒氣或輔助氣時，還要設(shè)定這些氣體的流量。有關(guān)檢測器的說明書通常會列出適合的氣體流量，可供參考，如用毛細管柱和FID時，檢測器氣體流量可設(shè)定為：空氣，300~400mL/min；氫氣，30~40ml/min；氮氣（尾吹氣）30~40ml/min。必要時可根據(jù)分析結(jié)果作進一步的優(yōu)化。

(6)進樣方式的選擇

液體進樣一般采用1μL、10μL或50μL微量注射器，用手動方式，插人進樣器至針底部，快速注射并快速拔出注射器?；虿捎脙x器配置的自動進樣器進樣，手動進樣偏差為±(5%~10%)，自動進樣為±2%。大量重復(fù)氣體分析應(yīng)采用六通閥手動或自動定體積進樣，進樣閥一般裝在進樣器前端。也可以用氣密性注射簡手動進樣，但進樣重現(xiàn)性較差。

以上初始條件設(shè)定后，便可進行樣品的嘗試性分析。一般先分離標準樣品，然后分析實際樣品，在此過程中，還要根據(jù)分離情況不斷進行條件優(yōu)化。

4.分離條件優(yōu)化

分離優(yōu)化是一個很大的題目，有專門的優(yōu)化理論來研究，市場上還有計算機軟件可用于優(yōu)化。在這里我們只討論操作條件、柱溫和載氣流速的優(yōu)化。事實上，當樣品和儀器配置確定后，我們除了可更換色譜柱外，還可改變柱溫和載氣流速，以期達到最優(yōu)化的分離。柱溫對分離結(jié)果的影響要比載氣的影響大。

簡單地說，分離條件的優(yōu)化目的就是要在最短的分析時間達到符合要求的分離結(jié)果。所以，當在初始條件下樣品中難分離物質(zhì)的分離度R大于1.5時，可采用增大載氣流速、提高柱溫或升溫速率的措施來縮短分析時間，反之亦然。比較難的問題是確定譜圖中的峰是否為單一組分的峰，這可用標準樣品對照，也可用GC-MS測定峰純度。如果某一感興趣的峰是兩個以上組分的共流出峰，優(yōu)化分離的任務(wù)就比較艱巨了。在改變柱溫和載氣流速都無法達到基線分離的目的時，就應(yīng)考慮是更換更長的色譜柱還是更換不同固定相的色譜柱，因為在氣相色譜中，色譜柱是分離成敗的關(guān)鍵。

影響峰展寬的因素：理想情況下，經(jīng)色譜分離的峰應(yīng)當為高斯分布曲線，即對稱峰。但實際上當一個樣品譜帶沿著色譜柱前進時，由于濃度差等原因，樣品分析會向譜帶兩側(cè)擴散，從而使色譜柱出口處的樣品譜帶比柱入口處寬，且可能產(chǎn)生不對稱的峰，這就是譜帶展寬。譜帶展寬的程度主要用柱效來表示，色譜峰越對稱，峰越窄，柱效就越高。

影響譜帶展寬的因素很多，但不外乎柱內(nèi)和柱外兩類。柱內(nèi)因素是指色譜柱本身的性能，如柱活性大小、固定相是否與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)、柱效是否足夠高、樣品是否超載等。柱外因素則主要指接頭的死體積、進樣口和檢測器死體積等。在氣相色譜中，柱外因素導(dǎo)致譜帶展寬的程度要比柱內(nèi)因素小得多。

5.定性與定量分析

（1）定性分析

是鑒定試樣中的各組分，即每個色譜峰是何種化合物。基于氣相色譜分離的主要定性依據(jù)是保留值，包括保留時間、保留指數(shù)等，也可以根據(jù)檢測器給出選擇性響應(yīng)信號或與其他儀器聯(lián)用定性。

① 保留值定性

最常用的方法就是通過標準物質(zhì)對照來定性，在相同的色譜條件下，分別注射標準樣品和實際樣品，根據(jù)保留值即可確定色譜圖上哪個峰是要分析的組分。定性時需要注意的是，在一定的色譜條件下，每個化合物具有一定的保留值，但是不同的化合物可能具有相同的保留值。按保留值確定試樣中不存在某個化合物一般是可靠的，而較準確鑒定一個色譜峰是某個化合物，常需要改變色譜條件，通常是在兩個不同的色譜柱上定性，稱為雙柱體系定性。

② 檢測器選擇性定性

氣相色譜檢測器一般有通用型和選擇型兩種，前者對所有化合物均有響應(yīng)，后者只對某些類型的化合物有響應(yīng)。如TCD為通用型檢測器，而FID只對有機化合物有響應(yīng)，根據(jù)TCD和FID有無響應(yīng)，可鑒別試樣中有機物和無機物。

③ 與其他儀器聯(lián)用定性

紅外光譜、質(zhì)譜等結(jié)構(gòu)分析儀器提供分子結(jié)構(gòu)信息，可對化合物直接定性。氣相色譜與這些儀器聯(lián)用，將質(zhì)譜等作為色譜的檢測器，不僅可以定量測定，還可以利用質(zhì)譜的定性特性對混合物成分進行定性。GC與MS的聯(lián)用大大擴展了氣相色譜的應(yīng)用范圍。

（2）定量分析

是根據(jù)檢測響應(yīng)信號大小，測定試樣中各組分的相對含量，其依據(jù)是每個組分的含量與色譜檢測器的峰高或峰面積響應(yīng)值成正比。常用的氣相色譜定量方法包括峰面積歸一化法、外標法和內(nèi)標法。

① 峰面積歸一化法

如果待測樣品各組分在色譜操作條件下都能出峰，而且已知其相對定量校正因子，則可以用歸一化法測定各組分的含量。該法不需要稱樣和定量進樣，操作簡單方便，儀器及操作條件的輕微變動對結(jié)果的影響小，適用于多組分同時定量測定。但缺點也同樣明顯，樣品中各組分都必須洗出且可測得其峰面積，不能有不產(chǎn)生信號或未洗出的組分，而且所有組分的定量校正因子都必須已知，這讓歸一化法的應(yīng)用受到了一定的限制。

② 外標法

當氣相色譜操作條件嚴格控制不變時，在一定進樣量的范圍內(nèi)，物質(zhì)的濃度與峰高呈線性關(guān)系，配制一系列不同濃度的已知樣品，分別取同樣體積的樣品注射進氣相色譜，根據(jù)所得色譜峰峰高或峰面積，做出標準曲線。分析未知樣品時，注進與制作標準曲線同樣體積的樣品，按所測得的色譜峰峰高或峰面積，從標準曲線上查出未知樣品濃度。外標法比較簡單，常用于日?？刂品治?。定量結(jié)果的準確性主要取決于進樣量的重復(fù)性和操作條件的穩(wěn)定程度，為了獲得較高的準確性，在日常工作中，定量校準曲線需要經(jīng)常重復(fù)校正。

③ 內(nèi)標法

內(nèi)標法是選擇一種樣品中不存在的物質(zhì)作為內(nèi)標物，定量地加入到已知質(zhì)量的樣品中，通過測定內(nèi)標物和樣品中組分的峰面積，引入校正因子，就可計算樣品中待測組分的含量。內(nèi)標物一般要求是高純化合物；與試樣中各組分很好分離，且不與組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；分子結(jié)構(gòu)、保留值和檢測響應(yīng)最好與待測組分相近。內(nèi)標法可以獲得較高的準確度，因為有內(nèi)標進行校正，所以可以不需定量進樣，可避免進樣時體積變化帶來的不確定因素，而且不需要所有的組分均被洗出。

2.氣相色譜開發(fā)方法的驗證

方法驗證就是要證明所開發(fā)方法的實用性和可靠性。實用性一般指所有儀器配置是否全部可作為商品購得，樣品處理方法是否簡單易操作，分析時間是否合理，分析成本是否可被同行接受等。

1.方法的線性范圍

即檢測器響應(yīng)值與樣品量（濃度）成正比的線性范圍，它主要由檢測器的特性所決定。原則上，這一線性范圍應(yīng)覆蓋樣品組分濃度整個變化范圍。線性范圍的確定通常是采用一系列（多于3個）不同濃度的樣品進行分析，以峰面積（或峰高）對濃度進行線性回歸。當相關(guān)系數(shù)大于0.995時，就可以認為是線性的，小于0.995時，就超出了線性范圍。一個好的氣相色譜定量方法，其線性范圍（以FID檢測器為例）可達107，線性相關(guān)系數(shù)≥0.999。

2.方法的檢測限

檢測限（DL）是指方法可檢測到的最小樣品量（濃度）。一般的原則是按照3倍信噪比計算，即當樣品組分的響應(yīng)值等于基線噪聲的3倍時，該樣品的濃度被作為最小檢測限，與此對應(yīng)的該組分的進樣量就叫作最小定量限。當用于法規(guī)分析時，這一數(shù)據(jù)應(yīng)等于或低于法規(guī)方法所要求的實際樣品中待測組分的最低允許濃度。

3.方法的回收率

方法回收率指方法測得的樣品組分濃度與原來樣品中實際濃度的比率。如果樣品未經(jīng)任何預(yù)處理，則回收率一般可不考慮。只有當某些樣品組分被儀器系統(tǒng)不可逆吸附時，回收率才是需要考慮的問題。如果樣品經(jīng)過了預(yù)處理，如萃取工藝，那就必須考慮整個方法的回收率。一般要求回收率大于80%，越接近100%越好。

回收率可用下述簡單方法測定：配置一定濃度的標準樣品，將其兩等分，其中一份按照方法步驟進行預(yù)處理，然后用GC分析；另一份則不經(jīng)預(yù)處理而直接用GC分析。兩份樣品所得待測組分峰面積的比率乘以100%即是該組分的回收率。有時實際樣品很復(fù)雜，特別是樣品基質(zhì)對預(yù)處理的回收率影響較大時，必須用空白樣品基質(zhì)（確定不含待測物）制備標準樣品，比如測定廢水中有機農(nóng)藥殘留量時，就要采用不含農(nóng)藥的水作空白基質(zhì)，在其中加人已知量的農(nóng)藥標準品，然后進行處理和分析。處理后所測得的組分含量與處理前加入量的比率乘以100%就得到了回收率。

回收率太低時會影響方法的檢測限。當樣品處理過程較復(fù)雜時，應(yīng)分別測定回收率，最后針對回收率最低的步驟進行方法改進，以期提高整個方法的回收率。

4.方法的重復(fù)性和重現(xiàn)性

重現(xiàn)性是指同一方法在不同時間、地點、不同型號的儀器、不同操作人員使用時所得結(jié)果的一致性。與此近似的另一個術(shù)語是重復(fù)性，常指同一個人在同一臺儀器上重復(fù)進樣所得結(jié)果的一致性。事實上，文獻中兩者常?；煊茫鄶?shù)人不作嚴格區(qū)分。對現(xiàn)代儀器來說，分析重復(fù)性是容易實現(xiàn)的，而重現(xiàn)性則是更重要的，也是方法驗證所必須考察的。重現(xiàn)性和重復(fù)性都用多次分析所得結(jié)果的相對標準偏差（RSD）來表示。

方法的重現(xiàn)性應(yīng)包括多次連續(xù)進樣分析的重復(fù)性、不同時間（天與天之間）分析的重復(fù)性、不同型號儀器之間的重現(xiàn)性和不同實驗室之間的重現(xiàn)性。首先應(yīng)測定重復(fù)性，即在相同條件下連續(xù)進樣5-10次，統(tǒng)計待測組分的保留時間和峰面積（或峰高）的相對標準偏差，一般要求保留時間的相對標準偏差不大于1%，峰面積的相對標準偏差不大于5%。

如果樣品要預(yù)處理，還應(yīng)測定同一樣品多次處理的重復(fù)性，即同一樣品取3-5份做平行處理，看最后測定結(jié)果的重復(fù)性。這一相對標準偏差值應(yīng)不大于5%。

當上述重復(fù)性滿足要求后，說明該方法在這個實驗室是可靠的。要將此方法作為標準方法推廣使用，還必須測定不同儀器、不同實驗室之間的重現(xiàn)性。當這些重現(xiàn)性的相對標準偏差都能滿足要求時，這一方法的可靠性就得到了較滿意的驗證。

根據(jù)以上步驟，我們就可以系統(tǒng)地建立和優(yōu)化氣相色譜分析方法，從而確保分析結(jié)果的準確性和可靠性。希望這個開發(fā)方法對你有所幫助！

1.檢測指標