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在實驗室的分析工作中，液相色譜法無疑是科研人員手中的 “利器”。但當遇到極性化合物時，這把 “利器” 常常會 “失手”。別擔心，今天就給大家?guī)硪黄瑢嵱玫母韶浳恼?，讓你輕松應對液相色譜分離極性化合物的難題！

一、反相色譜柱分離極性化合物的困境

反相色譜柱，如 C18 鍵合相柱，通常依靠分析物與烷烴鏈之間的疏水相互作用來分離物質。然而，對于有機酸 / 堿類化合物、多羥基化合物以及偶氮類等極性化合物，它們含有羧基、氨基、羥基等可解離部分，極性較大。在經(jīng)典反相 C18 類鍵合相上進行分離時，會出現(xiàn)容量因子K 過小，導致化合物在死時間附近出峰的情況。

即使在梯度分析方法開發(fā)時，降低起始有機相比例，甚至以純水相作為起始流動相，也難以有效保留這些極性化合物。而且，還會出現(xiàn)峰展寬、C18 色譜柱固定相孔內去濕現(xiàn)象（Dewetting），進而導致化合物保留時間減少、色譜峰峰形異常等問題，拖尾現(xiàn)象尤為常見。

二、孔內去濕現(xiàn)象大揭秘

反相 HPLC 一般以水為弱洗脫相，甲醇、乙腈等有機試劑為強洗脫相。在梯度洗脫過程中，有機相比例在 5% - 100% 范圍內變化。對于極性化合物，即使有機相比例為 5%，也難以有效保留。當有機相比例進一步降低至 0% 時，就會引發(fā)色譜柱多孔內表面及固定鍵合相的去濕現(xiàn)象。

[圖 1 反相 C18 鍵合相上孔內去濕現(xiàn)象]

如圖所示，當有機相比例在 5% 及以上時，流動相可以輕松浸入固定相基質多孔內，浸濕內表面及 C18 烷烴鏈，C18 鏈呈自由伸展構象，能與樣品組分的疏水部分良好相互作用，實現(xiàn)適當保留。而使用 100% 水相時，盡管可以增大色譜柱前段壓力使純水相浸入基質多孔內部，但無法有效浸濕內表面及 C18 鏈。由于色譜柱沿流動相流動方向的壓力降現(xiàn)象，整個色譜柱的浸濕狀態(tài)差異很大。當柱前壓減小時，純水相會被 “排出” 孔隙，導致去濕現(xiàn)象發(fā)生，如圖 1 所示。

圖2 反相色譜柱壓力降

C18 鏈在孔內去濕現(xiàn)象發(fā)生前后的構象變化如圖 3 所示。在典型反相 HPLC 流動相下（水相 ≤95%），C18 鏈呈自由伸展構象；而在 100% 水相下，C18 鏈相互 “交聯(lián)”，靠近內表面，形成疏水屏蔽層，失去與待分離組分疏水部分相互作用的能力，導致保留時間變短。

[圖 3 C18 鏈在孔內去濕現(xiàn)象發(fā)生前后]

三、極性化合物分離的挑戰(zhàn)

在反相 C18 色譜柱上分析極性化合物時，常面臨以下問題：

（一）保留時間過短

化合物本身或在體系中解離后極性過大，油 - 水分配系數(shù)過小，無法與疏水選擇性基團發(fā)生足夠相互作用，隨起始流動相直接流出色譜柱。

圖4 極性化合物

（二）色譜峰峰形拖尾

靜電相互作用 ：有機酸類化合物在流動相 pH 大于其 pKa 時解離帶負電，與硅膠基質上殘留金屬離子發(fā)生靜電相互作用；有機堿類化合物在流動相 pH 小于其 pKa 時解離帶正電，與弱酸性的硅羥基產(chǎn)生靜電相互作用。

氫鍵相互作用 ：多羥基、羥基 - 胺類有機化合物以及未解離有機酸堿類化合物與硅羥基之間存在氫鍵相互作用。

溶劑選擇不當 ：溶解極性化合物的溶劑不合適，也會導致色譜峰拖尾。

四、極性化合物分離策略全解析

（一）非封端短鏈烷烴鍵合固定相

這種色譜柱的特點是硅膠基質表面裸露的硅羥基不封端，鍵合固定相鏈長度小于 C8。由于固定相烷烴鏈長度短于 C18，多孔內疏水性減小，表面硅羥基不封端使純水相與多孔接觸角變小，相比典型 C18，孔內去濕現(xiàn)象可能性大大降低。同時，這種色譜柱在分離樣品組分時，吸附作用及硅羥基氫鍵相互作用占主導地位。

（二）極性封端與極性增強型固定相

該色譜柱采用極性或親水性封端試劑對表面裸露的硅羥基進行封端，C18 鍵合密度較低。與典型 C18 色譜柱相比，內表面水浸潤性增加，孔內疏水性相對減小，允許使用 100% 水相。

（三）極性內嵌烷基固定相

這種色譜柱在長鏈烷基靠近硅膠內表面的一端，內嵌入甲酸酯基類、脲或酰胺基、硫酰胺基等極性改性官能團。極性內嵌使整個鍵合相親水性增強，多孔內疏水性減小，在 100% 水相條件下，極性內嵌烷烴鏈保持自由伸展構象。此外，內嵌極性基團對表面裸露的硅羥基有屏蔽作用，減小極性化合物尤其是堿性化合物的拖尾因子，使色譜峰峰形更對稱。

通過對色譜柱硅膠表面或烷烴鏈改性，如增加內表面極性大小及烷烴鏈內嵌極性官能團，可提高多孔內表面及固定相的水浸潤能力，減少或避免孔內去濕現(xiàn)象。同時，調整 HPLC 操作方式及改變色譜條件，也能對極性化合物的保留因子及峰形進行優(yōu)化。