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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-02-27 09:07
流式細(xì)胞術(shù)的測定對象是單細(xì)胞或單個微粒，在FCM技術(shù)中能夠制備出合格的單細(xì)胞懸液是非常重要的環(huán)節(jié)，單細(xì)胞懸液來自于動植物的不同組織器官，也可來自于非生物樣品，F(xiàn)CM中大多數(shù)為生物樣品，生物樣品主要來源于培養(yǎng)細(xì)胞、血液、新鮮實體組織以及石蠟包埋組織等，不同的組織有不同的單細(xì)胞分散方法，因此建立切實可行的FCM單細(xì)胞懸液的具體制備方法，在流式細(xì)胞分析中至關(guān)重要。
1、新鮮實體組織單細(xì)胞懸液制備
FCM對細(xì)胞的各種參數(shù)分析必須基于單細(xì)胞的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同實體組織成分的特點，下面介紹幾種單細(xì)胞懸液制備方法，僅供參考。
(一)酶消化法
酶的作用原理主要有三方面：一是破壞組織間的膠原纖維、彈性纖維等，二是水解組織細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，三是水解組織間的粘多糖物質(zhì)。酶消化法是實體組織分散為單細(xì)胞的主要方法之一。
酶消化法常規(guī)程序如下:
1.將適合于酶消化的組織置于離心管中。
2.將選好的酶溶液1~2ml加入盛有被消化組織的試管中。
3.常規(guī)消化20~30min(恒溫37℃或室溫)，消化期間間斷振蕩或吹打。
4.終止消化，收集細(xì)胞懸液，以300目尼龍網(wǎng)過濾，除去細(xì)胞團(tuán)快，以低速離心除去細(xì)胞碎片。
5.加入PBS 2ml充分混勻，離心棄掉上清，再加入0.5ml PBS重懸細(xì)胞。
6.將制備好的單細(xì)胞懸液進(jìn)行熒光標(biāo)記后上機(jī)檢測或保存?zhèn)溆谩?/span>
(二)機(jī)械法
機(jī)械法分散實體組織包括:用剪刀剪碎組織或用鋒利的解剖刀剁碎組織，用勻漿器勻漿，用細(xì)注射針頭反復(fù)抽吸細(xì)胞等，最后用300目尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞得到單細(xì)胞懸液。
1.剪碎法
(1)將組織快放入平皿中，加入少量生理鹽水。
(2)用剪刀將組織剪至勻漿狀。
(3)加入10ml生理鹽水。
(4)用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管內(nèi)。
(5)離心沉淀1000rpm/min，4~5min，再用生理鹽水洗3次，每次以短時低速（500~800rpm/min)離心沉淀去除細(xì)胞碎片。
(6)以300目尼龍網(wǎng)過濾去除細(xì)胞團(tuán)塊。
(7)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?70%冰乙醇等)固定細(xì)胞或低溫保存?zhèn)溆谩?/span>
2.網(wǎng)搓法
(1)將100目、300目尼龍網(wǎng)扎在小燒杯上。
(2)把剪碎的組織放在網(wǎng)上，用眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直到將組織搓完。
(3)收集細(xì)胞懸液，離心沉淀細(xì)胞500~800rpm/min，2分鐘。
(4)固定細(xì)胞或低溫保存?zhèn)溆谩?/span>
3.研磨法
(1)先將組織剪碎成1~2mm 3小塊。
(2)放入組織研磨器中加入1~2ml生理鹽水。
(3)轉(zhuǎn)動研棒，研至勻漿。
(4)加入10ml生理鹽水，沖洗研磨器。
(5)收集細(xì)胞懸液，并經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀細(xì)胞，500~800rpm/min，2min，再以生理鹽水洗3遍，離心沉淀。
(6)固定或低溫保存細(xì)胞，備用。
(三)化學(xué)處理法
化學(xué)處理法的主要原理是:將組織細(xì)胞間起粘連作用的鈣、鎂離子置換出來，從而使細(xì)胞分散下來。
(1)將組織切成薄片，置入試管。
(2)首先加入EDTA液5ml，室溫下0.5小時，離心棄之。
(3)加入胰酶-EDTA液5~10ml，置37℃恒溫水浴30min，間斷振蕩3~5次。
(4)用300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀1000rpm/min，5min，再以生理鹽水洗2~3次，離心500~800rpm，1~2min。
(5)將細(xì)胞固定或低溫保存?zhèn)溆谩?/span>
上述幾種方法都是目前對實體組織解聚的常用方法。要根據(jù)實驗?zāi)康娜ミx擇合適的單細(xì)胞懸液制備方法，才能獲得理想的樣本和更好的FCM檢測結(jié)果。
注意事項：
①需要注意的是酶學(xué)方法的使用條件和影響因素(如酶濃度、酶效價、作用時間、pH值)等，例如胃蛋白酶在堿性環(huán)境下失去活性、胰酶在中性溶液中活性欠佳。
②采用網(wǎng)搓法同樣也可獲得大量細(xì)胞，但機(jī)械法容易造成細(xì)胞碎片和細(xì)胞團(tuán)快，因此常與其他方法配合使用。
③新鮮組織標(biāo)本應(yīng)及時處理保存，避免細(xì)胞自溶導(dǎo)致DNA降解。
④根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇最佳固定方式;如采用酶學(xué)法需注意酶的溶劑、消化時間、pH值、濃度等，同時根據(jù)組織成分合理選用酶類，例如含大量結(jié)締組織腫瘤，如食管癌、乳腺癌、皮膚癌等應(yīng)選擇膠原酶。
2、石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液制備
石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液的制作方法的建立擴(kuò)大了流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍，并有大量臨床隨訪資料，因此非常有利于進(jìn)行回顧性研究和利用。下面介紹常用石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液制備方法。
1.切片:將石蠟包埋組織切成40~50μm厚3~5片，放入10ml試管中。
2.脫蠟:加入二甲苯5~8ml脫蠟(室溫)1~2天，視石蠟脫凈與否，更換1~2次二甲苯，待石蠟脫凈后棄掉二甲苯。
3.水化:依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步10min，去乙醇，加入蒸餾水3~5ml，10min后棄之。
4.消化:加入2ml0.5%胃蛋白酶(pH1.5~2.0)，置37℃恒溫水浴中消化30min，消化期間每隔10min振蕩1次。
5.終止消化:消化30min后立即加入生理鹽水。
6.經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾:未消化好的組織可做第2次消化。
7.離心、漂洗:收集細(xì)胞懸液，離心沉淀1500rpm/min，5min，再以生理鹽水漂洗1~2次，離心沉淀500~800rpm/min，去碎片。
8.低溫保存細(xì)胞備用。
注意事項:
①切片不宜過薄或過厚，過薄則碎片增多，影響流式分析結(jié)果，過厚則脫蠟不凈或脫蠟時間過長。一般適宜厚度為40~50μm;
②必須將石蠟脫干凈，檢驗石蠟是否脫凈的方法是棄去二甲苯，加入100%乙醇，如果無絮狀物漂浮可視為蠟已脫凈，反之則未脫凈;
③消化時間不宜過長，以避免細(xì)胞核被消化溶解;
④消化后的組織先用剪刀剪碎后再消化或?qū)⒔M織片放在300目尼龍網(wǎng)上，用圓滑底部的試管磨碎，再用PBS沖洗，如此反復(fù)就可得到較多的細(xì)胞。
3、培養(yǎng)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液制備
培養(yǎng)細(xì)胞一般以懸浮或貼壁方式生長。對懸浮生長細(xì)胞先用吸管反復(fù)吹打的方式分散聚團(tuán)的細(xì)胞，然后常規(guī)洗滌、低速離心法去碎片、沉淀細(xì)胞，再次懸浮即可獲得單細(xì)胞懸液。
下面主要介紹貼壁生長細(xì)胞單細(xì)胞懸液制備方法。
1.消化:將培養(yǎng)細(xì)胞用0.04%乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA·2Na)或0.29%胰蛋白酶消化3~7min(據(jù)室溫情況靈活掌握)，在顯微鏡下見到貼壁細(xì)胞之間出現(xiàn)篩狀間隙為止，棄去消化液，加PBS液。
2.收集細(xì)胞:用吸管將細(xì)胞從瓶壁上輕輕吹打下來，移入離心管中。
3.低速離心:即800~1000rpm/min，5min。棄上清，
4.反復(fù)漂洗、離心:加PBS(pH 7.4) 5~8ml混勻，低速離心，同上。重復(fù)2~3次
以去除細(xì)胞碎片。
5.獲得單細(xì)胞懸液:加少許PBS將沉淀細(xì)胞輕輕吹打均勻，即可獲得單細(xì)胞懸液。
6.低溫保存或固定細(xì)胞備用。
4、外周血單細(xì)胞懸液制備
在生理狀態(tài)下，血液中細(xì)胞成分呈分散的游離狀態(tài)，因此血細(xì)胞是FCM最合適的樣品，血細(xì)胞成分包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等有形成分，白細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)主要是對某一類細(xì)胞群為對象，因此常常把某一群細(xì)胞單獨分離出來做分析。一般采集抗凝血樣后，樣本管平行放置在18~25℃室溫下保存，6h之內(nèi)處理。根據(jù)不同實驗?zāi)康倪x擇合適的抗凝劑，比如EDTA-K?或EDTA-K3抗凝劑終濃度為1.5~2mg/ml，肝素抗凝劑為1000U/ml。下面介紹幾種血液單細(xì)胞成分制備方法，僅供參考。
(一)單個核細(xì)胞制備
1.取肝素抗凝血2ml，用生理鹽水2ml稀釋至 4ml。
2.取3ml淋巴細(xì)胞分離液放入10ml離心管中，再將4ml稀釋好的血沿試管內(nèi)壁緩緩加入到分離液面之上，保持清晰的分層狀態(tài)，切勿用力過大導(dǎo)致血液和分離液混合。
3.室溫(18~20℃)下，離心2000rpm/min，30min。離心后可見試管內(nèi)的血液清晰地分為4層:上層為血漿;中層為分離液;上層和中層之間白色薄層為淋巴細(xì)胞層;底層為紅細(xì)胞層;紅細(xì)胞層上面為粒細(xì)胞層。
4.用吸管將上層與中層之間的淋巴細(xì)胞吸出，收集到另一離心管中，用生理鹽水或Hank 液稀釋至10ml。
5.離心洗滌2次，每次均以1500rpm/min，10min，棄上清后加入少許生理鹽水或培養(yǎng)液，即得到大量單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，包括高純度的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。
6.固定細(xì)胞或置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>
(二)單核細(xì)胞制備
1.在無菌條件下，取肝素(1000U/ml)抗凝全血3ml，加入3ml生理鹽水將血稀釋。
2.取 1640 培養(yǎng)液10ml加入培養(yǎng)皿中，再加入已稀釋的血混勻后放入恒溫箱內(nèi)孵育30~40min，注意加大液體與培養(yǎng)皿接觸面。
3.取出培養(yǎng)皿，將血傾倒掉，用生理鹽水輕輕沖洗一次培養(yǎng)皿，去掉殘留的血液，此時培養(yǎng)皿壁上貼附了大量單核細(xì)胞。單核細(xì)胞具有短時間內(nèi)易貼壁的特性，而其他細(xì)胞不貼壁，根據(jù)這個特性可獲得較純的單核細(xì)胞。
4.室溫下，用0.25%胰蛋白酶消化10~15min，通過不斷搖震或用橡皮刷輕刮瓶壁方式，促使細(xì)胞脫落下來，切勿用力過大導(dǎo)致細(xì)胞損傷過多。
5.離心沉淀脫落細(xì)胞，1500rpm/min，5min，再以生理鹽水漂洗2~3次，每次離心800rpm/min，3min，去除碎片雜質(zhì)，即可獲得較多的單核細(xì)胞。
6.將細(xì)胞固定或低溫保存?zhèn)溆谩?/span>
(三)粒細(xì)胞制備
1.用淋巴細(xì)胞分離液對外周血分層(參見單個核細(xì)胞制備)。
2.粒細(xì)胞層位于分離液底部、紅細(xì)胞之上。以吸管輕輕吸出粒細(xì)胞層，置另一個離心管中，加入5ml Hank液洗滌3次，每次離心1500rpm/min，10min。
3.加入2ml低滲液(Hypotonic Lysis)30~40秒，以去除紅細(xì)胞。
4.再以 Hank液洗滌2次，即可獲得高純度粒細(xì)胞。
5.將細(xì)胞固定或低溫保存?zhèn)溆谩?/span>
5、骨髓有核細(xì)胞懸液的制備
1.抽取骨髓0.5ml，滴入含肝素(1000U/ml)抗凝劑的2ml PBS 液中。
2.再加入 PBS液稀釋至4ml。
3.將稀釋的4ml骨髓液緩慢加入到盛有3ml人類淋巴細(xì)胞分層液面之上，避免骨髓液與分層液混合。
4.離心沉淀2000rpm/min，20min。此時淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、髓性細(xì)胞、白血病細(xì)胞等有核細(xì)胞層位于PBS和淋巴細(xì)胞分層液之間。
5.吸取有核細(xì)胞層，加入至10ml PBS液中混勻。
6.離心沉淀細(xì)胞，1000rpm/min，5min，棄上清。
7.加固定液或少量PBS液，置低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>
6、活檢、內(nèi)鏡取材標(biāo)本單細(xì)胞懸液制備
對腫瘤組織、淋巴結(jié)等活檢組織以及各種鏡檢取材標(biāo)本均可做單細(xì)胞懸液，因標(biāo)本量少，制備起來較麻煩，一般鏡檢取材標(biāo)本至少取3塊以上，制備方法與實體組織基本類似。
1.取下來的組織立即放入盛少許PBS的青霉素小瓶中。
2.另取一只小燒杯，杯口用300目尼龍網(wǎng)蓋住，用線繩固定好，并用PBS液濕潤，取下的標(biāo)本放在尼龍網(wǎng)上。
3.用PBS液濕潤剪刀，反復(fù)剪碎組織，待無明顯組織塊時，用先前的小瓶中的PBS 沖洗勻漿并過濾于小燒杯中，如果仍見組織塊繼續(xù)剪碎，再沖洗，直至網(wǎng)上無組織塊為止。
4.得到的細(xì)胞固定或低溫保存?zhèn)溆谩?/span>
7、脫落細(xì)胞的單細(xì)胞懸液制備
在臨床工作中我們常常會遇到脫落細(xì)胞檢查，比如宮頸脫落細(xì)胞、食管拉網(wǎng)脫落細(xì)胞、胸腹水以及尿液脫落細(xì)胞等，從中收集脫落細(xì)胞做各種熒光抗體標(biāo)記后進(jìn)行FCM檢測，這對臨床診斷和治療很有意義。
(一)宮頸脫落細(xì)胞
1.首先用生理鹽水沖洗宮頸表面分泌物，以海綿輕拭宮頸表面，將海綿上吸附的脫落細(xì)胞洗脫到20ml生理鹽水中。
2.收集細(xì)胞懸液離心沉淀，1500rpm/min，5min，再用生理鹽水洗滌2次。
3.棄上清后加入70%乙醇固定或低溫保存?zhèn)溆谩?/span>
(二)食管拉網(wǎng)脫落細(xì)胞
1.將拉網(wǎng)器上的脫落細(xì)胞洗脫到10ml生理鹽水中，先在1500rpm/min，5min條件下離心沉淀，再用生理鹽水洗滌2次，800rpm/min，2min，棄上清。
2.再加入生理鹽水5ml，以300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清。
3.加少許生理鹽水混勻細(xì)胞，低溫保存或固定備用。
(三)尿液脫落細(xì)胞
1.用清潔器皿收集24h尿液，置4℃冰箱中自然沉淀細(xì)胞，輕輕倒去上清液，留下少許含細(xì)胞的沉淀物，用吸管移至20ml離心管中，離心500rpm/min，10min，棄上清。
2.加 PBS液10ml混勻后離心，1000rpm/min，10min，去上清，再重復(fù)洗一次。
3.加5ml PBS混勻，用300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清。
4.加少許 PBS 混勻，加固定液或低溫保存?zhèn)溆谩?/span>
(四)胸、腹水脫落細(xì)胞
1.抽取胸、腹水200~300ml，加入1000U/ml肝素鈉5ml，置6~12小時后棄上清。
2.吸取沉淀液20ml入試管內(nèi)，用PBS液洗3次，1500rpm/min，5min。
3.再加5ml PBS液混勻，用300目尼龍網(wǎng)過濾后離心沉淀去上清。
4.加少許 PBS 液混勻，加固定液或低溫保存?zhèn)溆谩?/span>
參考資料：
https://umanitoba.ca/health-sciences/research/flow-cytometry
https://images.app.goo.gl/jsq6fnEiPKSpeHtB6
https://images.app.goo.gl/mcFiQouZK2zuAUmh9
https://images.app.goo.gl/tquLCNNpRDN99bURA
來源：實驗老司機(jī)我叫一休
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