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溶出曲線是口服固體制劑最重要的基本屬性之一，此外，復(fù)制注射劑和一些口服溶液劑也會(huì)要求與參比制劑進(jìn)行體外溶出曲線對比。常用的溶出曲線比較方法包括f1差異因子法、f2相似因子法、多變量置信區(qū)間法和f2bootstrap法。

 在2015年2月5日發(fā)布的《普通口服固體制劑溶出度試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》中提到了f1法和f2法，因?yàn)閒1法在溶出曲線比較時(shí)更寬松，所以在后續(xù)的指導(dǎo)原則中沒有再出現(xiàn)，我們最常用的方法是f2法。f1和f2方法的原理及詳細(xì)使用對比參見作者以前的文章《溶出曲線對比f1、f2法詳解》。

當(dāng)溶出曲線第一個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的溶出量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差超過20%，或其他取樣時(shí)間點(diǎn)的溶出量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差超過 10%時(shí)，f2法不再適用。根據(jù)2022年11月8日發(fā)布的《已上市化學(xué)藥品藥學(xué)變更研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》溶出曲線研究的問答，此時(shí)可以選擇多變量置信區(qū)間法或f2bootstrap法。此兩種方法有各自的適用范圍，作者在《溶出曲線對比法之f2bootstrap法》對f2 bootstrap法進(jìn)行了詳細(xì)的講解。本文主要針對多變量置信區(qū)間法進(jìn)行梳理，以期望同仁們在遇到類似問題時(shí)，能夠合理選擇評價(jià)方法。

一、何為多變量置信區(qū)間法？

為了理解多變量置信區(qū)間法，我們先了解下單變量置信區(qū)間法，雖然這個(gè)概念我們很少聽說，但是我們實(shí)際工作中也有類似的應(yīng)用，比如BE等效的判定標(biāo)準(zhǔn)即90%的置信區(qū)間下應(yīng)80.00%~125.00%，就采用了置信區(qū)間法。

舉個(gè)例子，12個(gè)計(jì)量單位的參比制劑15min的溶出數(shù)據(jù)分別為76.3、79.2、82.5、78.6、81.3、77.9、79.2、83.8、80.9、75.6、81.5、80.5，平均溶出度為79.78，標(biāo)準(zhǔn)差為2.45。仿制藥15min的溶出數(shù)據(jù)分別是85.4、83.6、82.9、81.8、84.8、79.3、80.8、78.3、85.2、81.3、79.3、83.4，平均溶出度為82.18，標(biāo)準(zhǔn)差為2.43。如果用點(diǎn)估計(jì)兩者溶出度之間的差異，則點(diǎn)估計(jì)差異D=82.18-79.78=2.4，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度來看，如果需要估計(jì)的更準(zhǔn)確，應(yīng)該使用區(qū)間估計(jì)，畢竟測定溶出選擇的樣品或溶出數(shù)據(jù)都會(huì)引入誤差。根據(jù)區(qū)間估計(jì)的公式“點(diǎn)估計(jì)±誤差”，下限L90=2.4-t22,0.05×合并方差；上限U90=2.4+t22,0.05×合并方差。其中t22,0.05可以查表得1.7171，其中22代表自由度，參比制劑自由度11（12-1），仿制藥自由度11（12-1），所以合并的自由度是22。下限0.05加上限0.05等于0.1，因?yàn)?-0.1=0.9即90%，所以代表90%的置信水平。合并方差=√[(2.452+2.432)/11]=1.039。所以參比制劑和仿制藥15min溶出度如果用區(qū)間估計(jì)，差異的下限L90=2.4-1.7171×1.039=0.62，差異上限U90=2.4+1.7171×1.039=4.18。雖然在藥學(xué)對比時(shí)，采用點(diǎn)估計(jì)應(yīng)用較多，其實(shí)區(qū)間估計(jì)更嚴(yán)謹(jǐn)，只是很多時(shí)候點(diǎn)估計(jì)已經(jīng)能夠說明問題罷了。

以上案例即單變量置信區(qū)間法，所謂的單變量是指僅有15min一個(gè)時(shí)間點(diǎn)這個(gè)變量。理解了單變量置信區(qū)間法，就比較容易理解多變量置信區(qū)間法了，所謂多變量，即不止一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變量，溶出曲線對比肯定不是一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的對比，而是多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的比較。

二、多變量置信區(qū)間法的步驟

對于批內(nèi)溶出量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差大于15%的藥品，可能更適于采用非模型依賴多變量置信區(qū)間方法進(jìn)行溶出曲線比較。2015年2月5日發(fā)布的《普通口服固體制劑溶出度試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》給出了多變量置信區(qū)間法的比較步驟。

2.1測定參比樣品溶出量的批間差異，然后以此為依據(jù)確定多變量統(tǒng)計(jì)矩（Multivariate statistical distance，MSD）的相似性限度。

根據(jù)2.4的判定原則可知這一步非常重要，因?yàn)樽罱K判定結(jié)果是否等效與參比制劑批間最大的相似性限度直接相關(guān)。所以，能夠獲得多批次參比制劑的數(shù)據(jù)是前提條件，尤其是參比制劑批次間的MSD越大越有利。參比制劑批次間每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平均溶出量差異越大，MSD越大。

不過仿制藥開發(fā)時(shí)，出于成本和注冊的要求，一般僅采購三批參比制劑，這很可能無法獲得較大的MSD，也就導(dǎo)致了仿制藥和參比制劑溶出曲線采用此方法很難相似，判定的準(zhǔn)確性存疑。為什么說準(zhǔn)確性存疑呢？因?yàn)椴捎么朔椒ㄓ?jì)算參比制劑不同批次之間，仍然會(huì)判定為不相似，我們能說參比制劑批次間BE不等效嗎？如下圖所示的三批參比制劑，最大的MSD是參比2和參比3的1.1381，參比1和參比2的MSD是0.6974，參比1和參比3 MSD是0.9468。根據(jù)多變量置信區(qū)間法的步驟選擇最大的1.1381為限度值，假設(shè)仿制藥的溶出數(shù)據(jù)和參比1完全一致，仿制藥（參比1）和參比3的MSD上限是2.4417，大于1.1381的限度，判定為不相似。將參比3與自身相比，計(jì)算的MSD上限是1.4949，仍然大于1.1381的限度，判定為不相似。因?yàn)閰⒈戎苿┲g都無法判定相似，所以我們有理由認(rèn)為此方法特別苛刻且準(zhǔn)確性存疑。

其實(shí)，根據(jù)作者對本法的思考和理解，這種方法更適合上市后的變更，因?yàn)橛蟹浅６嗯蔚臍v史溶出數(shù)據(jù)，也就能找到最大的MSD，變更后的溶出曲線與變更前的多變量統(tǒng)計(jì)距對比，應(yīng)該落到判定等效結(jié)果內(nèi)，否則，判定為不等效。

2.2確定受試和參比樣品平均溶出量的MSD。

參比制劑不同批次的MSD與受試和參比樣品之間的MSD計(jì)算方法一致，但與參比制劑批次間的需求不同，受試和參比樣品之間的MSD越小越好，這樣才能得到更小MSD的90%置信區(qū)間上限。在做BE試驗(yàn)之前進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估時(shí)或提交注冊申報(bào)資料時(shí)，需要提交BE批次的受試制劑和參比制劑的MSD。根據(jù)下圖MSD的計(jì)算公式可知，參比制劑和受試制劑的溶出曲線各時(shí)間點(diǎn)的距離差值越小，MSD越小。參比制劑和受試制劑各時(shí)間點(diǎn)溶出的RSD越大，MSD越小。

2.3確定受試和參比樣品實(shí)測溶出量MSD的 90% 置信區(qū)間。

因?yàn)?.4項(xiàng)下的判定以置信區(qū)間的上限與參比制劑的相似限度進(jìn)行比較，所以，需要使上限盡可能的小，才有可能判定相似。如何讓上限盡可能的小呢？正如2.2項(xiàng)下表述，應(yīng)該使參比制劑和受試制劑的溶出曲線各時(shí)間點(diǎn)的距離差值最小、參比制劑或受試制劑各時(shí)間點(diǎn)溶出的RSD最大。MSD本質(zhì)上就是距離，各時(shí)間點(diǎn)的距離差值越小，兩條溶出曲線越接近，MSD越小，這一點(diǎn)比較好理解。如何理解需要參比制劑或受試制劑各時(shí)間點(diǎn)的RSD大呢？可以參考下圖， 假如參比和受試樣品的溶出曲線RSD可以忽略（左圖），那么兩條溶出曲線的距離就是我們實(shí)際觀察到的距離。假如參比和受試樣品的溶出曲線RSD非常大（右圖），平均溶出量不變，考慮到RSD波動(dòng)后，受試樣品和參比制劑可能互相包含，你中有我，我中有你，自然兩者的MSD會(huì)變小。

2.4如果受試樣品的置信區(qū)間上限小于或等于參比樣品的相似性限度，可認(rèn)為兩個(gè)批次的樣品具有相似性。

最后一個(gè)步驟是判定原則，至此，已經(jīng)完成了樣品的檢驗(yàn)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，是否具有相似性一目了然?；谝越K為始的目標(biāo)，理解如何判定相似的基本原理，才能在一開始選擇參比制劑的批次、受試制劑的溶出曲線開發(fā)目標(biāo)做出最好的選擇。

三、多變量置信區(qū)間如何計(jì)算？

多變量置信區(qū)間的計(jì)算會(huì)用到馬氏距離，這個(gè)公式非常復(fù)雜，如果感謝興趣可以繼續(xù)看，如果看不懂也沒有關(guān)系，能會(huì)用軟件計(jì)算或者記住本文第二節(jié)的原理和結(jié)論即可。

根據(jù)FDA公布的參考文獻(xiàn)（Statistical Assessment of Mean Differences Between Two Dissolution Data Sets），給出了一批參比制劑和一批仿制藥的溶出數(shù)據(jù)，見表1。

表1  一批參比制劑和一批仿制藥溶出數(shù)據(jù)

計(jì)算參比制劑和仿制藥的協(xié)方差矩陣，對角線為各時(shí)間點(diǎn)的方差，15min的方差等于15min的單個(gè)溶出值減去15min的平均值，然后平方，6個(gè)平方求和后再取平均值。15min和90min的協(xié)方差等于15min的單個(gè)溶出值減去15min的平均值，再乘以90min的單個(gè)溶出值減去90min的平均值，6個(gè)乘積求和后再取平均值。完整的協(xié)方差矩陣見表2。

表2 參比制劑和仿制藥協(xié)方差矩陣

將參比制劑的協(xié)方差矩陣和仿制藥的協(xié)方差矩陣進(jìn)行合并，即(S1+S2)/2，每一個(gè)對應(yīng)數(shù)值相加除以2，得到新的復(fù)合協(xié)方差矩陣，見表3。

表3參比制劑和仿制藥合并后的協(xié)方差矩陣

有了以上溶出數(shù)據(jù)和協(xié)方差矩陣，我們就能根據(jù)馬氏距離的計(jì)算公式算出MSD。根據(jù)FDA參考文獻(xiàn)中的案例，計(jì)算兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)15min和90min的MSD，更多時(shí)間點(diǎn)的計(jì)算類似，只是計(jì)算更為繁瑣，篇幅限制，不再展示。

首先將馬氏距離公式分成三個(gè)部分，（x-μ）T、∑-1和（x-μ），其中（x-μ）T是（x-μ）的行列變換，行變成列，列變成行，見下圖。其實(shí)都是同一個(gè)數(shù)組，即15min和90min參比的平均溶出量減去仿制藥的平均溶出量，記作（-17.54，3.39）。

據(jù)協(xié)方差矩陣表3，可知15min和90min的協(xié)方差矩陣由σ11=3.396，σ12=1.030，σ21=1.030，σ22=4.435構(gòu)成。Σ矩陣和∑-1矩陣見下圖。

其中det（∑）=σ11*σ22-σ12σ21=3.396*4.435-1.030*1.030=13.999；

       1/det（∑）=0.0714; 最后得出∑-1矩陣是

將已經(jīng)求出的馬氏距離公式的三個(gè)部分相乘，如下圖，得到兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的MSD=10.44，與FDA參考文獻(xiàn)計(jì)算結(jié)果一致。

有了MSD值和上述計(jì)算結(jié)果，根據(jù)MSD的置信區(qū)間CR公式見下圖。

其中K=(n2/2*n)(2*n-p-1)/[(2*n-2)*p]，n為每個(gè)溶出點(diǎn)的樣本，本例為6片，P為比較的時(shí)間點(diǎn)個(gè)數(shù)，本例為15min和90min兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即P=2，可以計(jì)算K=1.35。F值可以查F分布表為3.01，可以計(jì)算出置信區(qū)間的上限=Dm+√（F/K）=10.44+1.493=11.93，下限=Dm-√（F/K）=10.44-1.493=8.95，與FDA參考文獻(xiàn)值計(jì)算結(jié)果一致。因?yàn)镕和K的值只和樣本數(shù)量、取樣點(diǎn)有關(guān)，所以，多變量統(tǒng)計(jì)距Dm一旦確定，置信區(qū)間上下限也就確定了。

四、結(jié)語

對于批內(nèi)溶出量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差大于15%的藥品，多變量置信區(qū)間法在進(jìn)行參比制劑和仿制藥溶出曲線對比時(shí)，不是一個(gè)比較理想的方法，似乎是在碰運(yùn)氣，如2.1中所述，哪怕重合的曲線，因?yàn)閰⒈萂SD選擇問題，都會(huì)導(dǎo)致判定不相似。f2bootstrap法似乎更理想，是首選方法。該方法更簡單，也比較貼合實(shí)際情況，當(dāng)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均溶出量較為接近時(shí)，容易判定為相似。

不管是f2相似因子法，還是多變量置信區(qū)間法或f2bootstrap法，都是體外評價(jià)溶出曲線相似的一個(gè)工具，對于仿制藥來說，能夠在體外評價(jià)相似又能夠體內(nèi)BE等效，當(dāng)然是皆大歡喜的事情。如果通過各種努力真的無法做到全部介質(zhì)中體外評價(jià)相似，但是體內(nèi)BE等效了，那也不用怕，畢竟體內(nèi)BE才是金標(biāo)準(zhǔn)。或者換句話說，我們選擇的體外溶出方法是否過于苛刻了？